最適化された測色RTの開発

Apr 04, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 21424 (2022) この記事を引用

2099 アクセス

1 引用

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

コロナウイルスのパンデミックにより、分子診断検査の必要性が強調されました。この目的でよく使用される技術はポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) です。これは、分子診断のゴールドスタンダードとして一般的に使用される高感度かつ特異的な技術です。ただし、高度な訓練を受けた人材とメンテナンスの必要な機器が必要であり、比較的時間がかかります。代替手段はループ媒介等温増幅 (LAMP) 技術です。これはサンプル精製や高価な機器を必要とせず、感度と特異性の点で PCR に似ています。この論文では、ポータブルデバイスを使用して、新型コロナウイルス感染症 (COVID-19) を診断するために最適化された比色逆転写酵素ループ媒介等温増幅 (RT-LAMP) ポイントオブケアテストを開発しました。プライマー、硫酸マグネシウム、ベタイン、塩酸グアニジン、Bst の濃度、反応温度などの変数をテストしました。また、反応試験管に添加されたサンプルの不足による偽陰性を回避するために、色素の組み合わせを使用したピペッティング品質管理システムも作成しました。加熱蓋が利用できない場合の蒸発を避けるために、鉱油が RT-LAMP 反応の組成に組み込まれました。最終的な RT-LAMP テストは、New England Biolabs の WarmStart Colorimetric Master mix と比較すると 10 倍感度が高く、感度は 1 μL あたり 5 コピーです。

2019 年 12 月、世界は重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 (SARS-CoV-2) と呼ばれる新しいコロナウイルスの結末を目の当たりにしました。 SARS-CoV-2 による最初の感染例は中国の武漢で報告され、すぐに世界中に広がり、2020 年 3 月に新たなパンデミックとして通知されました 1。パンデミックの発生により、分子生物学の世界的な必要性が明らかになりました。病気の蔓延を制御する手段として、感染者を特定し、隔離し、治療するための検査。

逆転写ポリメラーゼ連鎖反応 (RT-PCR)2 は、SARS-CoV-2 などの RNA ウイルスの分子検査のゴールドスタンダード技術として一般に知られています。 RT-PCR は感度と特異性が高い技術ですが、高価でメンテナンスに手間がかかる装置、広範なサンプル精製手順、および高度な訓練を受けた人員が必要です。感染者の急速な増加に伴い、分子検査のための試薬、投入物、人員、設備の不足が明らかになり、世界では需要を満たすための検査室リソースの不足が生じました。

ループ媒介等温増幅 (LAMP) は、等温条件下で実行可能な高い特異性と効率を備えた核酸増幅技術として、20003 年に納富らによって初めて記載されました。これは、鎖置換 DNA ポリメラーゼ (5' → 3' エキソヌクレアーゼ活性を除去) と、合成された一本鎖 DNA にループを作成するように設計された 2 ～ 3 対のプライマーのセットを使用します。ポリメラーゼが新たな増幅を開始するたびに、以前にペアになっていた DNA 鎖が解放され、ポリメラーゼの新しい結合部位を含むループ構造が形成され、自己増殖増幅が生じます。反応の最終生成物は、ターゲットの交互逆反復の間のアニーリングによって形成された複数のループを備えたカリフラワーのような構造です3。 PCR と同様に、LAMP 反応を逆転写酵素と組み合わせて RNA 分子の増幅を行うこともできます。

LAMP 反応では高度な DNA 合成が行われるため、陽性反応を視覚的に検出できます。 DNA ポリメラーゼが新しく合成された DNA 鎖に dNTP を組み込むたびに、副産物としてピロリン酸とプロトン分子が放出されます。ピロリン酸は、Mg2+ イオンの存在下でピロリン酸マグネシウムとして沈殿し、反応の濁度を変化させます。放出されたプロトンは反応の pH を低下させます。これは、フェノールレッドやブロモチモールブルーなどの pH 感受性比色色素を使用することで検出できます4,5。

等温比色核酸増幅検査 (NAAT) は、新型コロナウイルス感染症のパンデミックへの対応において中心的な役割を果たしています。これらはサーモサイクラーを必要としないだけでなく、サンプル処理も簡素化され6、結果は肉眼で判断できます。これらの技術はポイントオブケアおよび治療 (POCT) 設定に適用され、デジタルセンサーが反応制御と分析を支援して成功を収めています。簡単なセットアップに加えて、比色 RT-LAMP は、RGB (赤、緑、青) 検出による POCT 診断テストでも使用でき、大規模なフィルターや検出器の必要性を排除しながら精度を向上させることができます。時間経過データを分析すると、蛍光システムと同様の増幅曲線が得られます7。

ここでは、試薬濃度の微調整、オペレーターのための品質管理手順、蒸発管理、安定性など、Hilab® Molecular POCT デバイスでの使用に最適化された、SARS-CoV-2 をターゲットとする比色 RT-LAMP アッセイの体系的な開発を実行します。。

完全な実験マトリックスは 192 の異なる条件で構成されました (表 S1)。肯定的反応と否定的反応の両方について、各応答パラメーターに対してモデルが定義され、α (α) = 0.05 の標準化効果のパレート図に基づいて因子が維持または削除されました。実験は 1 回の反復で実行し、異常値は曲線の形状と予想される結果に基づいて手動で削除されました。図 1 は、残基プロファイルと正規確率プロットを含む実験結果の分析を示しています。残留物分布のプロファイルにより、モデルの適合は許容可能であると判断されました。モデルの ANOVA を図 2 に示します。図 3 は、初期増幅時間 (Xt) と反応時間 (TTR) (増幅デルタの 50% に達するまでの時間) を最小化することを目的とした応答の最適化を示しています。 -陽性反応のNmax（反応の最初の色と最後の色の間の色の変化のデルタ）を最小限に抑え、陰性反応のNmaxを最小限に抑えます。

ソフトウェア Minitab で得られた、陽性反応の反応時間 (TTR) 応答を最小限に抑えることを目的とした実験結果の分析。 (A) 残差プロット。正規確率プロットは、分析された残差が正規分布していることを表します。ヒストグラムは残差の分布を表します。残差対適合プロットは残差がランダムに分布していることを示し、残差対順序プロットはデータが収集された順序で残差を示し、観測順序にパターンがないため残差が独立していることを示します。 (B) α = 0.05 の正規確率プロット。有意な因子は順に、プライマー配列 (F)、Bst 濃度 (B)、プライマー濃度 (A)、硫酸マグネシウム濃度 (C)、および次の組み合わせです。プライマー配列と塩酸グアニジン pH (FG) の調整。

テストされた因子とそれぞれの P 値を使用してソフトウェア Minitab から取得された TTR 応答の ANOVA。プライマー濃度 ([Primer])、Bst 濃度 ([Bst])、硫酸マグネシウム濃度 ([MgSO4])、プライマー配列 (Primer) などの要因は統計的に有意でした (p < 0.05)。

Minitab から得られた応答の最適化。陽性反応の初期陽性率 (Ini_post) と TTR (TTR_post) を最小化し、陰性反応の Nmax (カラーデルタ) を最小化し、望ましさ 0.989 で得られます。最適な応答を達成するために、最終モデルは 1 倍濃度のプライマー、0.4 U/μL (50% に相当) の Bst、8 mM の硫酸マグネシウム、400 mM のベタイン、N および Orf1ab 配列をターゲットとするプライマー、および温度 67 でした。 ℃。

陽性反応の TTR 応答の結果をモデル化すると、プライマー配列、酵素濃度、硫酸マグネシウム、プライマー濃度がこの順序で重要な因子として得られます。非線形回帰を使用した増幅開始 (Xt) と変曲点の手動決定のモデリングは本質的に同じでした。モデル化された応答変数を最小化するための最適化が実行され、要因プロットと望ましさプロットを使用して、分析された要因の対象範囲が決定されました。プライマー濃度は 1 倍 (テストした最大値) が最適であることが判明し、濃度が低いと TTR 値が増加します。温度が高いほど、反応時間にプラスの効果がありました。プライマー配列のタイプは NE ペアの方が悪く、残りの 2 つの組み合わせではほぼ同じでしたが、塩酸グアニジン (Gu-HCl) ストック溶液の pH 調整は、評価された応答にほとんどまたはまったく影響を与えないようです。

ネガティブコントロール反応の Nmax のモデルも受け入れられ、R2 は 67.28% でした。モデルの要因プロットは、ポリメラーゼと硫酸マグネシウムの濃度が増加すると非特異的増幅が起こる傾向を示します。ベタイン濃度間には反比例の関係が観察されます。予想通り、温度が低いと非特異的増幅の可能性が高くなります。

ソフトウェア Minitab を通じて、3 つのモデルすべて (陽性反応の TTR と初期増幅時間 (Xt) の最小化、陰性反応の Nmax の最小化) を考慮して、分析される各変数についてより適切な決定を下すことができます。 Minitabを使用すると、分析された各応答の重要性を集計して、すべての応答パラメータを考慮してより適切な適合を与えることができます。ここで、3 つの応答には同じ重要度 (重み 1) が与えられていますが、分析された 3 つの応答のうち 2 つでは、パラメータ時間 (TTR および初期時間) が ${\raise0.5ex\hbox{ $\scriptstyle 2$} \kern-0.1em/\kern-0.15em \ lower0.25ex\hbox{$\scriptstyle 3$}}$ の結果から変数を選択します。 3 つのモデルすべてを考慮して、ソフトウェアは最適なレベルを提案します。このラウンドの最適化後の最良の要因は、プライマー濃度 1 倍、Bst 0.5 倍 (0.4 U/μL)、硫酸マグネシウム 8 mM、ベタイン 400 mM、反応温度 67 °C でした。選択したプライマーの組み合わせは 1AN (遺伝子 N および Orf1ab 配列) でした。

上記の最適化された条件を使用すると、60 分間の増幅後でも偽陽性の結果は観察されませんでした (補足ファイル)。

試験した各指示薬色素のカラーシフトの pH 範囲を表 1 に示します。

私たちは、ストック溶液の調製の複雑さ、時間と温度に対する安定性、染料の沈殿、およびカラーシフトに対する pH 範囲に基づいて pH 指示薬を分析しました。色素は色の彩度に影響を与える可能性があるため、Molecular HilabⓇ デバイスのさまざまな反応量で色素を評価しました。メーカーによると、Bst 酵素は pH 5 ～ 10 で安定しており、この範囲外にある色素、または下限と上限の両方に近すぎる色素は潜在的な指標として無視されました。図 S1 は、テストした各 pH 指示薬色素の色の勾配を示しています。

メタクレゾールパープルは、超純度 1 型ヌクレアーゼを含まない水または TE バッファーに完全に溶解しなかったため、その後のテストから除外されました。 Molecular HilabⓇ デバイスは反応結果を色の時系列で表示するため、無色の溶液として開始される pH 指示薬色素を使用すると、反応チューブが挿入されていないと解釈される可能性があります。そのため、o-クレゾールフタレインとα-ナフトールフタレインは指標候補として除外されました。

ブロモチモールブルーとブロモクレゾールパープルは、良好な色の変化 (それぞれ濃い青と紫から黄色へ) と安定性を示しました。クレゾールレッドとクロロフェノールレッドは、NEBのLAMPマスターミックスですでに使用されているフェノールレッドと同様の結果をもたらしました。スクリーニングの後、ブロモチモールブルーが最も安定な pH 指示薬として選ばれ、青から黄色への大きな色変化を示しました。これは色相スケールで 180° の差に相当します。 RT-LAMP 反応におけるブロモチモールブルーの最適濃度はテストされ、100 μM と定義されました。これより低い濃度では水色になり、それを超えると反応 TTR が増加するためです (データは示されていません)。

反応開始 pH の影響を評価するために、1 ～ 4 µL の 10 mM KOH (水酸化カリウム) の添加をテストしました。分析されたパラメータは、TTR と Nmax でした。興味深いことに、両方のパラメーターに有意な差は観察されませんでした。ただし、TTR が最も低く、Nmax がより高い条件は、最終反応で 1.2 mM KOH を使用した場合に得られました。陽性対照を使用した場合 (1 × 106 ゲノム当量/反応)、Nmax は約 54 (± 4)、TTR は 420 秒でした (図 S2)。

ポイントオブケアテストとして、私たちの目的は、オペレーターの操作を最小限に抑え、簡素化するキットを開発することでした。手順を容易にすることを目的として、サンプル溶液中の色素のいくつかの組み合わせをテストしました。そうすることで、オペレーターはサンプルが反応チューブに追加されたかどうか、ピペッティングされた量が正しいかどうかを確認できるため、サンプルの追加不足による偽陰性の結果を回避できます。これまでの研究で、LAMP 反応では pH 指示薬色素の組み合わせが使用できることが示されていたため 8、ブロモチモールブルーとフェノールレッドまたはクレゾールレッドの組み合わせを反応でテストしました。

ブロモチモールブルーとクレゾールレッドを組み合わせると、サンプル添加後に濁った青みがかった色になりました (図 4 - チューブ 25 ～ 32)。 30 分間の増幅後、ポジティブコントロールチューブ (33 ～ 35 および 37 ～ 39) の色は、非テンプレートコントロール (NTC) (チューブ 36 および 40) とわずかに区別できました。フェノールレッドは、サンプル溶液の組成に使用する最適な染料として選ばれました。サンプルを添加した後、反応の色は青 (チューブ 1 ～ 8) から紫 (チューブ 9 ～ 16) に変わり、オペレーターには色の変化が認識されました。増幅の場合、最終的な色は明るい黄色 (チューブ 17 ～ 19、21 ～ 23) であり、NTC チューブ (20 および 24) とは明確に区別されました (図 4)。さらに、染料の組み合わせにより満足のいく Nmax と TTR (< 600 秒) を得ることができました。

67 °C で 30 分間インキュベートする前後のさまざまな色素との反応。チューブ 1 ～ 8 にはブロモチモールブルーのみが含まれており、サンプルを添加する前の反応の色を示しています。サンプル溶液にはフェノールレッドまたはクレゾールレッドが含まれていました。チューブ 9 ～ 16 は、フェノールレッドを含む溶液をサンプルに添加した後のチューブ 1 ～ 8 を表し、チューブ 17 ～ 24 は 67 °C で 30 分間インキュベートした後のものです。チューブ 25 ～ 32 は、クレゾールレッドを含む溶液をサンプルに添加した後のチューブ 1 ～ 8 を表し、67 °C で 30 分間インキュベートした後の結果はチューブ 33 ～ 40 でした。チューブ 12、16、28、および 32 は非テンプレート対照でした。チューブ内の色素の最終濃度は次のとおりです。チューブ 1 ～ 4 には 50 μM ブロモチモールブルーが含まれていました。 5 ～ 8 には 100 μM ブロモチモールブルーが含まれていました。 9 ～ 12 および 17 ～ 20 には、50 μM ブロモチモールブルーおよび 100 μM フェノールレッドが含まれていました。 13 ～ 16 および 21 ～ 24 には、100 μM ブロモチモールブルーおよび 100 μM フェノールレッドが含まれていました。 25 ～ 28 および 33 ～ 36 には、100 μM ブロモチモールブルーおよび 100 μM クレゾールレッドが含まれていました。 29-32 および 37-40 には、50 μM ブロモチモールブルーと 100 μM クレゾールレッドが含まれていました。

30 分間の増幅では偽陽性反応は観察されませんでした。

この論文で使用されている比色 LAMP 反応が pH に依存していることを考慮すると、サンプル溶液の pH が Nmax や TTR などの反応パラメーターに干渉するかどうかを分析する必要があります。サンプル溶液は、7 ～ 9 の範囲の 5 つの異なる pH (0.5 ずつ増加) でテストされました。何も調整しないと、溶液の pH は約 8.5 になったので、目的の pH を達成するには NaOH または HCl を追加する必要がありました。鼻咽頭スワブサンプルを溶液に入れてかき混ぜた後、ピンク色が濃くなり、ある程度の塩基性化を示していることを確認しました。

ヒト rActin の内部対照プライマーを使用してテストすると、すべての反応が陽性になりました (表 S2)。ただし、予想どおり、サンプル溶液の pH が高いと TTR が増加しました (表 S3)。 pH 7.0 ～ 7.5 のサンプル溶液は、反復間のより高い一貫性とより低い TTR 値 (それぞれ 642 ± 54 および 714 ± 24 秒) を示しました。

pH 変化に依存する比色反応は緩衝液と互換性がなく、通常は酵素保存緩衝液からのキャリーオーバーのみが含まれます。しかし、高濃度の酵素 (ストック溶液 120 U/μL) を使用すると、バッファーのキャリーオーバーが低くなり、ブロモチモールブルーを含む反応物が急速に酸性化することに気づきました。氷中で約 15 分間放置すると、反応色が青から緑がかった色に目に見える変化を引き起こすのに十分でした。私たちは、増幅ステップを妨げずにチューブの調製中の色の変化を防ぐ最適なトリス濃度があるかどうかをテストしました。反応混合物作製直後の各条件で得られたデルタ値（Nmax）と増幅の初期時間（Xt）を解析しました。

Tris 濃度が増加すると、増幅の初期時間も増加することが観察できました (図 S3)。 6 ～ 8 の pH 範囲における Tris の緩衝特性により、Tris の濃度が高くなるほど、反応の pH とその結果としての色が変化しにくくなります。 Tris 濃度と Nmax は反比例し、Tris の量が多いほど、試験した Tris の最低濃度 (510 μM) と比較して反応色のデルタ (Nmax) が低くなります。

サンプルを添加するさまざまな方法に大きな違いはありませんでした。つまり、サンプルを反応に添加する際に鉱油の存在は問題になりませんでした。さらに、0 または 5 μL のミネラルオイルを反応液に添加した条件でも、マイクロチューブのキャップに小さな液滴が観察され、マイクロチューブの底の体積が減少するため、蒸発は依然として発生しました (図 5)。ミネラルオイルがないと、増幅中に蒸発が発生し、捕捉された色の彩度が増加し、Nmax が高くなるため、Nmax の安定化を達成することができないことがわかりました。

67 °C で 60 分間増幅した後のミネラルオイルの効果。チューブ 1、2、および 7 には鉱油を添加しませんでした。チューブ 3 および 4 には 5 μL の鉱油を入れ、チューブ 5、6、および 8 には 10 μL の鉱油を入れました。チューブ 1 ～ 6 には SARS-CoV-2 陽性コントロールを入れ、チューブ 7 と 8 には陰性コントロールを入れました。

マイクロチューブのキャップ内に液滴が観察されず、テスト全体を通じてチューブの底の体積が変わらなかったため、最終プロトコルは 20 μL の反応液に 12 μL のミネラルオイルを添加するように設定されました。 Nmax値の安定化を実現します。鉱油を反応に添加した場合、TTR または感度に有意な差は観察されませんでした。

限界は、Nmax 平均 54 (± 26)、および増幅の初期時間 (Xt) 約 1302 秒 (± 396) で、陽性率 100% (10/10) で 1 μL あたり 5 ゲノム当量で確立されました (図 1)。 6および図S4）。テスト感度が同じかどうかを分析するために、輸送と保管をシミュレートするさらなる実験が実行されています。

遺伝子NまたはOrf1abのいずれかの部位に対応する合成DNA配列でクローン化されたプラスミドpUC57を含む対照溶液を使用した試験の検出限界。 (A) X 軸は、対数で表した反応あたりのコピー数での対照溶液の希釈であり、Y 軸は反応の Xt (秒単位の増幅の初期時間) です。 (B) x 軸は、反応ごとのコピー数での対照溶液の希釈度であり、y 軸は反応の Nmax です。

表 2 に、反応バッファーとサンプル溶液の最適化された組成をまとめます。鼻咽頭スワブサンプルは、95 °C で 10 分間加熱不活化することも、何も処理せずに反応に添加することもできます。サンプル添加後、67 °C で 30 分間増幅を行う必要があります。

比色 RT-LAMP 反応は分子 POCT 検査に革命をもたらし、qPCR9 のような分子アッセイの特徴である高感度と特異性を備えた安価な装置を可能にしました。肉眼観察による陰性反応と陽性反応の区別が容易なため、比色反応が一般的に使用されていますが、比色反応は、より単純なデータ収集システムのための高価で不安定な蛍光色素やフィルター設定の代替も可能にします。私たちの研究では、白色 LED と組み合わせた RGB 検出機能と WiFi または USB を介したインターネット接続を備えた Hilab® Molecular デバイスを使用しました。これにより、反応の同時モニタリングと医療専門家によるアッセイの遠隔評価が可能になります。本研究では、Hilab® Molecular デバイスを使用して、リモート POCT テスト分析に最適化された新しい処方を開発しました。

qPCR 反応による増幅された遺伝物質の定量は、温度サイクルによって測定でき、各サイクルで DNA の量が 2 倍になるため、反応の進行の解釈と初期サンプル負荷の推定が容易になります。一方、RT-LAMP 反応は単一温度で発生し、qPCR と比較すると複雑な反応速度になります。ただし、比色 LAMP 反応は、反応時間 (TTR)、増幅の初期時間 (Xt)、最大色変化 (Nmax) などのパラメーターとして記述することができます。それにもかかわらず、我々は、これらのパラメーターが DoE を使用した増幅率の定量的測定の経験的モデリングに依然として役立つことを示しました。約 200 の再現されていないテスト条件を使用して、5 つの連続変数と 2 つのカテゴリ変数について許容可能な条件が得られました。外れ値を除去しても、得られたモデルは許容可能であり、特定のアッセイ条件に最適化された条件を取得するために使用することに成功しました。

テストしたすべてのパラメーターの中で、N、ORF1ab、または E 遺伝子を対象としたプライマー配列、Bst、プライマー、および硫酸マグネシウム濃度が最も重要であることが観察されました (α = 0.05)。これは、成分の最適化をテストした他の論文と一致しており、酵素と MgSO4 濃度を増加させると反応のパフォーマンスが向上することがわかりました 10,11。私たちの場合、最適な濃度は 0.4 U/μL の Bst と 8 mM の MgSO4 でした。 NEB の SARS-CoV-2 用 WarmStart マスターミックス (Bst DNA ポリメラーゼ 2.0 を含む) は、0.5 ～ 5 mM の範囲の Tris を推奨しています12。達成可能な最低 Tris 濃度 (510 μM) では、より低い濃度が得られることがわかりました。 TTR。これは、pH 依存性色素の色の変化を可能にするために反応を弱く緩衝する必要があるため、Tris の緩衝特性と一致します。また、マスターミックスの pH を 7.5 ～ 9.0 にすることも推奨しています。 KOH 濃度をテストして、より低い TTR とより高い Nmax を与える反応の初期 pH を定義しました。テストした KOH 濃度では TTR または Nmax に統計的に有意な差はありませんでしたが、最終濃度 1.2 mM ではわずかに優れたカラーシフト (Nmax) が得られました。また、サンプル溶液の調製直後の反応の TTR と Nmax を測定することと、時間の経過に伴う pH の低下によって、サンプル溶液の pH 調整にも取り組みました。 pH 7 ～ 7.5 のサンプル溶液は、反応の TTR が低く、保管中の pH の安定性が良好です。さらに、より高い pH は、数週間の保管を通じて顕著な pH 低下を示しました (データは示されていません)。

塩酸グアニジン pH 8.0 は LAMP 反応を改善することが示されています 13。 Gu-HCl pH を 8.0 に調整しても、反応の TTR や Nmax に大きな影響を与えないことが観察されました。さらに、Gu-HCl の pH は時間の経過とともに低下しますが、これは長期間の保存には適合せず、使用直前の調整は POC テストと不適合です。試験されたもう 1 つの添加剤はベタインで、アッセイの特異性を向上させるために PCR および LAMP 技術で使用されています 14、15。濃度 400 mM のベタインを使用した場合、別の研究で見られたのとは異なり、非特異的な増幅は見られませんでした 15。

反応混合物中の色素の組み合わせは、比色分析 LAMP8 のアプリケーションを拡張するために以前にテストされていますが、ここでは、ピペット操作の制御として異なる色素の組み合わせを使用して、オペレーターがサンプルを反応チューブに追加したことを保証し、誤った添加を防ぎます。サンプル添加不足による陰性。サンプル溶液にはフェノールレッドが含まれており、ブロモチモールブルーを含む反応混合物にサンプルを添加すると、色が紫に変わります。遠隔で実行される検査の品質管理は、特に分子診断の場合には最も重要です。サンプルバッファーに色素が含まれていてもサンプル処理の効率には影響を与えないようであり、熱不活化にも影響を与える可能性は低いです。テストした 8 つの色素の中から、反応混合物を構成するためにブロモチモールブルー色素を選択し、サンプル溶液としてフェノールレッド色素を選択しました。その逆（反応混合物中のフェノールレッドとサンプル溶液中のブロモチモールブルー）は、サンプル溶液が暗くなり、診断製品として魅力的でなくなるため、承認されませんでした。どちらの色素も安定しており、pH 範囲は私たちの反応と互換性があり、色の変化は RGB システムでよりよく検出されました。さらに、これら 2 つの色素は比色 LAMP 反応で広く使用されています 4、8、16、17。

Hilab® Molecular デバイスには、生産を容易にし、可動部品の数を減らすことで堅牢性を高めるため、加熱蓋がありません。しかし、これにより反応が過度の蒸発を受けやすくなり、色の彩度の増加によって引き起こされる比色反応の誤解が生じる可能性があります。この問題を軽減するために、PCR 用のミネラルオイルが蒸発を防ぐことがテストされました 18。オイルを添加すると、シグナルや反応時間に悪影響を与えることなく、蒸発を完全に抑制して色を安定化できることがわかりました。鉱物油が鉱物油層の上に加えられたか下に加えられたかに関係なく、鉱物油の存在はサンプルの移送プロセスに影響を及ぼしません。ピペットを使ったり、チューブの側面を叩いたりして溶液を均質化しても、反応効率には影響しませんでした。数秒後に油層が再び確立されました。鉱油を事前に添加し、油とともに反応を凍結することができます。それに加えて、オイルを使用すると、ドライブロックなどのより簡単な設定で反応を実行できます。

達成された検出限界 (LoD) は、他の RT-LAMP アッセイと同様に、合成コントロールを使用した場合、100% 陽性で 1 μL あたり 5 コピーでした。 NEBのWarmStart Colorimetric LAMP 2X Master MixとSARS-CoV-2の遺伝子NおよびEを標的とするプライマーを使用して私たちの研究室で行われた以前の実験では、1μLあたり50コピー未満の検出限界を達成できませんでした（データは示されていません）。精製サンプルを使用した RT-PCR 検査の検出限界は、μL あたり 0.0819 ～ 1420 コピーの間で変化します 21、22、23。当社の LoD を直接綿棒を使用した他の分子検査と比較すると、市販の検査の LoD が 1 mL あたり 60,000 ～ 540,000 NDU であったとき、検出限界は 1 mL あたり 25,000 コピーでした24。ウイルス RNA コピー/mL は、ゲノムコピー当量/mL に相当します ( GCE/mL）または核酸検出可能単位/mL（NDU/mL）25。私たちの技術では未精製のサンプルを使用しているため、得られた結果は RT-qPCR アッセイとは比較されませんでした。

長期間保管した後でも LoD が同じままであるかどうかを確認するための安定性テストはまだ実行されていません。新型コロナウイルス感染症陽性の患者サンプルを用いた検査の臨床検証も必要だ。

ここで得られた結果は、最終反応量 20 μL に対して 4 μL のサンプル溶液を使用して達成されたことに留意することが重要です。サンプルの添加割合やサンプル溶液の組成が変化すると、結果が異なる場合があります。さらに、反応の総量を増やすと感度が向上します 26 が、テストのコストが増加する可能性があります。

ここでは、NEB の WarmStart Colorimetric LAMP Master mix と比較して 10 倍高い感度で、POCT 設定における核酸の比色検出の反応条件を最適化することに成功しました。当社のマスターミックスレシピは、色信号の差を最大化し、ターゲットシーケンスの増幅時間を最小化し、サンプル添加を制御することができ、冷蔵設定で使用できます。また、ミネラルオイルを添加することで、加熱蓋を使用しなくても、体積が蒸発することなく、より長い反応時間に対応できます。非特異的増幅も応答曲面法 (RSM) 最適化によって軽減されました。これらの機能強化により、可能な幅広い構成でよりコスト効率の高いスクリーニングテストが可能になります。

Bst 2.0 WarmStart® DNA ポリメラーゼ (M0538)、南極熱不安定性 UDG (M0372)、WarmStart® RTx 逆転写酵素 (M0380)、および dNTP (N0446S および N0459S) は、New England Biolabs (NEB) から入手しました。フェノールレッド (114529)、ミネラルオイル (M5904)、塩化カリウム (P9541)、水酸化カリウム (P5958)、硫酸マグネシウム (M3409)、Tween-20 (P9416)、塩酸グアニジン (G3272)、トリス塩酸塩 (93363) およびベタイン (B0300) は Sigma-Aldrich から入手しました。超純水タイプ I (10977) および TE バッファー pH 8.0 (93283) は Invitrogen から入手しました。ブロモチモールブルー (AB08416RA)、クレゾールレッド (VC09256RA)、クロロフェノールレッド (VC06226RA)、ブロモクレゾールパープル (PB06593RA)、メタクレゾールパープル (PM06383RA)、α-ナフトールフタレイン (AN07911RA)、および O-クレゾールフタレイン (C05368RA) 色素は、以下から入手しました。イソドシティフィカ。

使用されたプライマー配列は、SARS-CoV-2 の N 遺伝子、E 遺伝子 13、または Orf1ab 配列 27 をターゲットとしました。ヒト ACTB mRNA 配列を標的とするプライマーのセットを内部対照として使用しました (表 S2)。プライマーは HPLC 精製を使用して Exxtend から注文し、超純粋なタイプ 1 ヌクレアーゼを含まない水に 200 μM に再懸濁しました。ピペッティングを容易にするために、プライマーを 10 倍濃縮のプライマーミックスとして調製しました。内部対照プライマーミックスは ACTB プライマーのみで構成されていましたが、SARS-CoV-2 プライマーミックスは、N 遺伝子と E 遺伝子、N 遺伝子と Orf1ab 遺伝子、または E 遺伝子と Orf1ab 遺伝子のいずれかをターゲットとする 2 セットのプライマーの組み合わせで構成されていました。各混合物には、使用した各ターゲットに対して 16 μM の FIP および BIP プライマー、2 μM の F3 および B3 プライマー、および 4 μM ループプライマーが含まれていました。

凍結乾燥ポジティブコントロールはGenScriptから入手し、SARS-CoV-2の遺伝子N、遺伝子E、またはOrf1ab配列のいずれかをEcoRV部位にクローン化したpUC57プラスミドで構成されていました（表S2）。陽性対照を、超純粋タイプ 1 ヌクレアーゼフリー水で中間濃度まで希釈し、サンプル溶液 (後述) と混合して、各ターゲットの最終濃度 106 コピー/μL を達成しました。

サンプル溶液は、特に明記しない限り、10% TE 緩衝液 pH 8.0 (10 mM Tris および 1 mM EDTA)、0.1% Tween-20、および 500 μM フェノールレッドから構成されました。サンプル溶液を４μＬの体積で反応液に添加して、比色色素の最終濃度１００μＭを得た。

ACTB mRNAを標的とするプライマーを使用した実験では、無症状ボランティアの鼻咽頭（NP）スワブサンプルが訓練を受けた職員によって収集されました。次に、収集したサンプルを、500 μL のサンプル溶液を含む 1.5 mL 微量遠心管内で旋回させ、95 °C で 10 分間熱的に不活化しました。この研究で使用されたすべてのサンプルは、無料かつ明確な同意条項の署名の下で取得されました。

RT-LAMP反応は、特に明記しない限り、各標的遺伝子の最終濃度1.6μMのFIPおよびBIPプライマー、0.2μMのF3およびB3プライマー、および0.4μMのループプライマーを用いて実施した。 1.4 mM dNTP (1.4 mM dATP、dCTP、dGTP および 0.7 mM dTTP、dUTP)、0.4 U/μL の Bst 2.0 WarmStart® DNA ポリメラーゼ、0.3 U/μL の WarmStart® RTx 逆転写酵素、0.005 U/μL の Antarctic も存在しました。熱不安定性 UDG、400 mM ベタイン、40 mM 塩酸グアニジン pH 8.0、10 mM KCl、8 mM MgSO4、0.1% (v/v) Tween-20、100 μM ブロモチモールブルー、およびサンプル溶液 4 μL、合計20μLの反応。

特に明記しない限り、テストした反応プロトコールは 67 °C で 30 分間に設定されました。反応にはブロモチモールブルーとフェノールレッドという 2 つの pH 指示薬が含まれているため、チューブ内の色の変化によって陽性または陰性の結果が読み取られます。陽性反応の場合、新しく合成された DNA 鎖に dNTP が組み込まれる際のプロトンの放出によって引き起こされる反応の pH の低下により、最初の色が紫から黄色に変化しました。

カスタム RT-LAMP 配合に最適なパラメーターを決定するために、実験計画法のアプローチが採用されました。私たちは、5 つの連続因子 (DNA ポリメラーゼ、硫酸マグネシウム、プライマー、ベタイン濃度、反応温度) と 2 つの分類因子 (塩酸グアニジンの pH 調整 [ [はい/いいえ]、およびプライマー配列の組み合わせ [N/E、N/Orf1ab または E/Orf1ab])。ベタインおよび硫酸マグネシウムの高レベルと低レベルはミリモル濃度としてモデル化され、プライマー濃度は標準レシピからの分数としてモデル化されました。ポリメラーゼ濃度は、最大濃度 0.8 U/μL からの分数としてモデル化されました。反応の高レベルと低レベルは、元の温度 65 °C から + 2° または - 2° に設定されました。

Minitab 19 を使用して実験マトリックスを生成し、実行順序をランダム化し、データを分析しました。各条件について、ポジティブコントロール反応（1 × 106 ゲノム当量/反応）とネガティブコントロール反応を使用して、各条件の反応効率と非特異的増幅率を測定しました。分析された応答因子は、陽性反応と陰性反応の両方について、反応時間 (TTR)、Nmax、および増幅の初期時間 (Xt) でした。

公開された文献28,29に基づいて、ブロモチモールブルー、フェノールレッド、クレゾールレッド、クロロフェノールレッド、ブロモクレゾールパープル、メタクレゾールパープル、α-ナフトールフタレイン、O-クレゾールフタレインなどの他のpH指示薬色素を最終濃度50～200μMの範囲でテストしました。。ストック溶液は、1 mM TE 緩衝液中の 2 mM の色素として調製され、超純度の I 型ヌクレアーゼを含まない水で所望の濃度に希釈されました。 pH 勾配は、比色染料を 1 M NaOH または HCl と混合することによって得られました。

RT-LAMP テストが pH に依存していることを考慮すると、溶液の初期 pH が反応の TTR または Nmax に影響を与える可能性があるという仮説を立てました。これを検証するために、反応の最適な初期 pH をテストし、10 mM KOH で最終濃度 0.4 ～ 1.6 mM KOH に調整しました。チューブには、遺伝子 N および Orf1ab を標的とするプライマーと、上記のポジティブコントロールが含まれていました。

ブロモチモールブルーとクレゾールレッドおよびフェノールレッドの組み合わせを、サンプルと反応溶液の両方で最終濃度 50 ～ 200 μM の範囲でテストしました。採取した鼻咽頭スワブをサンプルとして使用し、反応には ACTB mRNA を標的とするプライマーを使用しました。非鋳型対照はサンプル溶液のみから構成された。色素は、LAMP 反応にサンプルを添加した後および陽性反応の終了時の色の変化に基づいて選択されました。

サンプル溶液を、条件間で 0.5 ずつ増加させて 7 ～ 9 の範囲の pH で調製しました。各 pH 条件には、ネガティブコントロールとして 1 つのチューブと、鼻咽頭スワブサンプルを含む技術的な 3 つが含まれていました。チューブには、ACTB mRNA を標的とするプライマーが含まれていました。

私たちのプロトコールは pH 反応の変化に基づいていたため、最終反応における理想的なトリスの濃度をテストしました。 LAMP 反応で使用した酵素とサンプル溶液の試薬の組成には Tris が含まれていたため、反応で達成できる Tris の最小濃度は 510 μM (試験した最低濃度) で、最高濃度は 1000 μM でした (NEB) Warmstart® RT-LAMP マスターミックスは最大 1000 μM の Tris で機能すると主張しています)。試験した最終濃度を達成するために、異なる体積の 10 mM トリス緩衝液を各反応に添加しました。チューブには遺伝子 N および Orf1ab をターゲットとするプライマーが含まれており、希釈陽性対照 (1000 ゲノムコピー/反応) を使用して、低ウイルス量サンプルをシミュレートしながら Tris 緩衝液の効果を検証しました。

Molecular Hilab® システムには加熱蓋がないため、溶液の蒸発が起こり、反応効率や色データの取得に影響を与える可能性があります。この問題を回避するために、反応ごとに 0 ～ 15 μL のミネラルオイルを添加してテストしました。また、鉱油の存在が反応混合物へのサンプルの添加を何らかの形で妨げる可能性があるかどうかもテストしました。サンプルを油を通して、その上と底に加え、チューブ内に意図的に泡を作りました。チューブには遺伝子 N および Orf1ab を標的とするプライマーが含まれており、陽性対照は前述のように使用されました。

RT-LAMP 反応の検出限界を検証するために、反応あたり 10 ～ 10,000 ゲノム当量の範囲の濃度のポジティブコントロールを使用しました。各希釈ポイントは 10 回の技術的反復で実行されました。対照をサンプル溶液で希釈し、前述のように Hilab® Molecular デバイス内で 67 °C で 30 分間反応を実行しました。我々は、100% の陽性率、つまりターゲットの増幅を得ることができる最大希釈として LoD を確立しました。

各最適化条件の結果を定量化するために、社内で開発されたソフトウェアが使用されました。このソフトウェアは、16 進数の色のテーブルシートを認識し、反応の色の変化に基づいてグラフを構築することができました。グラフの構築後、オペレーターは増幅の初期時間 (Xt) を手動で設定できるため、ソフトウェアはバックグラウンドを除去し、データの 4 パラメーター多項式回帰を使用してシグモイド曲線を構築します。ソフトウェアは各チューブの 3 つのパラメータも返しました。Nmax は増幅曲線のデルタ値、TTR は増幅デルタの 50% に達するまでの時間、R は反応効率に関連し、反応がプラトーに達する速さを表します。場合によっては、増幅の初期時間 (Xt) も分析しました。これらのパラメーターは、ここで報告するすべてのテストに対して計算され、各実験に最適な条件を決定するために使用されました。

Molecular Hilab® システムを使用して、比色反応を遠隔監視しました。このデバイスはサーモブロックと RGB センサーで構成されており、サンプルの加熱失活と冷却、反応を最適な温度に保ち、反応チューブの挿入を検出できます。デバイスへのチューブの挿入とサンプルの取り扱いは、オペレーターによって手動で行われます。反応データはカラー時系列として送信されます。データの収集後、2 つの画像が生成されます。1 つは反応終了までの反応色が徐々に変化する画像、もう 1 つは一連の色変化から構築され、時間の経過に伴う各チューブの曲線を示すグラフです。この装置を使用すると、例えば肉眼よりも正確かつ確実に反応管の色を分析することができます。これらの画像と既往歴アンケートが考慮され、生物医学専門家が検査の最終結果を 1 分以内に示します。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者である WB の Raddatz から入手できます。

新型コロナウイルス感染症に関するメディアブリーフィングにおけるWHO事務局長の冒頭発言。 https://www.who.int/director-general/speeches/detail/who-director-general-s-opening-remarks-at-the-media-briefing-on-covid-19---8 月 18 日- 2020年（2020年）。

Bustin, SA & Mueller, R. リアルタイム逆転写 PCR (qRT-PCR) と臨床診断におけるその潜在的な用途。クリン。科学。 109、365–379 (2005)。

記事 CAS Google Scholar

納富哲ほかループを介した DNA の等温増幅。核酸研究所 28、e63 (2000)。

記事 CAS Google Scholar

Dao Thi、VLL 他。臨床サンプル中の SARS-CoV-2 RNA を検出するための比色 RT-LAMP アッセイおよび LAMP シーケンス。科学。翻訳。医学。 12、eabc7075 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

ケルナー、MJ 他研究室および家庭での検査向けの、迅速かつ高感度でオープンアクセスな SARS-CoV-2 検出アッセイです。フロント。モル。生物科学。 9、801309 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Kang, T.、Lu, J.、Yu, T.、Long, Y. & Liu, G. 核酸増幅技術 (NAAT) の進歩: 例としての COVID-19 ポイントオブケア診断。バイオセンス。バイオ電子。 206、114109 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

パパダキス、G.ら。粗製サンプル中の核酸を迅速に定量的に検出するためのポータブルリアルタイム比色 LAMP デバイス。科学。議員第 12 号、1–15 (2022)。

記事 Google Scholar

ウー、Ｓ．ら。色素の組み合わせによる SARS-CoV-2 の比色等温核酸検出。ヘリヨン 7、e06886 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Garg, N.、Ahmad, FJ & Kar, S. 病原体の迅速かつ効率的な検出のためのループ媒介等温増幅 (LAMP) の最近の進歩。カー。解像度微生物。科学。 3、100120 (2022)。

CAS Google スカラー

周D.ら。迅速かつ視覚的なループ媒介等温増幅アッセイによるバートランスジェニックサトウキビの検出。フロント。植物科学。 7、279 (2016)。

記事 Google Scholar

スワルナ・ラクシュミ、KR 他ループ媒介等温増幅アッセイ: イネの褐斑病を引き起こすバイポラリスいもち病を検出するための特異的かつ高感度なツール。 Phytoparasitica 50、543–553 (2022)。

記事 Google Scholar

タナー、N. et al. 比色LAMPを使用した迅速診断テスト（2021）。

Zhang、Y.ら。塩化グアニジンによる比色ループ媒介等温増幅速度と感度の向上。バイオテクニック 69、179–185 (2020)。

記事 Google Scholar

Henke, W.、Herdel, K.、Jung, K.、Schnorr, D. & Loening, SA ベタインは、GC リッチ DNA 配列の PCR 増幅を改善します。核酸研究所 25、3957–3958 (1997)。

記事 CAS Google Scholar

フー、PC 他診断用途の実行可能な PCR 代替品としてのループ媒介等温増幅 (LAMP) 反応: 糞便サンプル由来の Entamoeba histolytica DNA に基づく、LAMP、従来の PCR、ネステッド PCR (nPCR)、およびリアルタイム PCR (qPCR) の比較分析研究。 BMCバイオテクノロジー。 20、34 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Jomoui, W.、Srivorakun, H.、Chansai, S. & Fucharoen, S. α0-サラセミアの迅速な同定のためのループ媒介等温増幅 (LAMP) 比色フェノールレッドアッセイ: 集団スクリーニングおよび出生前診断への応用。 PLoS ONE 17、e0267832 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Zhang, S. et al. 新しいインジケーターとステムループプライマーを利用した等温増幅により、トキソプラズマゴンディを視覚的に半定量的に検出できます。 Sens. アクチュエーター B Chem. https://doi.org/10.1016/j.snb.2022.132544 (2022)。

記事 Google Scholar

シングルトン、J. et al. HIV-1 の分子ポイントオブケア診断のための電気を使わない増幅と検出。 PLoS ONE 9、e113693 (2014)。

記事 ADS Google Scholar

Zhang、Y.ら。比色 LAMP を使用した SARS-CoV-2 (COVID-19) ウイルス RNA の迅速な分子検出。 medRxiv 2 (2020)。

黄、WEら。コロナウイルス SARS-CoV-2 の迅速診断のための RT-LAMP。微生物。バイオテクノロジー。 13、950–961 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Jiang, Y. et al. SARS-CoV-2 ウイルスの定量的 RT-PCR 検出の確立。ユーロ。 J.Med. 解像度 26、147 (2021)。

記事 CAS Google Scholar

Pfefferle, S.、Reucher, S.、Nörz, D. & Lütgehetmann, M. ハイスループットシステムを使用した新興コロナウイルス SARS-CoV-2 の検出のための定量的 RT-PCR アッセイの評価。ユーロサーベイランス 25、2000152 (2020)。

記事 Google Scholar

Barra、GB、Santa Rita、TH、Mesquita、PG、Jácomo、RH & Nery、LFA 自動ワークフローで実行された SARS-CoV-2 検出のための 2 つの RT-qPCR プロトコルの分析感度と特異度。 Genes 11、1183 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

FDA。 SARS-CoV-2 参照パネルの比較データ。 FDA。 https://www.fda.gov/medical-devices/coronavirus-covid-19-and-medical-devices/sars-cov-2-reference-panel-comparative-data (2020)。

サベラ、ES et al. 唾液および鼻腔スワブのペアにおける定量的な SARS-CoV-2 ウイルス量曲線は、ウイルスを早期に検出するために必要な適切な呼吸器サンプリング部位と分析検査感度を示します。 medRxiv Prepr. サーブ。健康科学 https://doi.org/10.1101/2021.04.02.21254771 (2021)。

記事 Google Scholar

Huang, X.、Tang, G.、Ismail, N.、および Wang, X. 唾液中の SARS-CoV-2 の迅速診断のための RT-LAMP アッセイの開発。 eBioMedicine 75、103736 (2022)。

記事 CAS Google Scholar

Wei, S. et al. 現場で展開可能な、SARS-CoV-2 の唾液の迅速診断検査。科学。議員 11、5448 (2021)。

記事 ADS CAS Google Scholar

Scott, AT、Layne, TR、O'Connell, KC、Tanner, NA & Landers, JP ループ媒介等温増幅指標の比較評価と定量分析。アナル。化学。 92、13343–13353。 https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c02666 (2020)。

記事 CAS Google Scholar

Tanner, NA、Zhang, Y. & Evans, TC pH 感受性色素を使用した等温核酸増幅の視覚的検出。バイオテクニック 58、59–68 (2015)。

記事 CAS Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

81270-185 PRクリチバHilab、Rua José Altair Possebom、800 - CIC

ブルーナ・ウィンカート・ラダッツ、エドソン・ユー・シン・キム、ルイーズ・マシュー・イマムラ、ジレーヌ・ジャレンコ・シュタイル、エリカ・ベルガモ・ジェームズ、ジェームズ・ピーター・ティム・ソアレス、ビクトル・エンリケ・アウベス・リベイロ、ベルナルド・モンテサンティ・マシャド・デ・アルメイダ、セルヒオ・レナト・ロガル・ジュニア、マルクス・ヴィニシウス・マゼガ・フィゲレド

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

資金調達: BMMA、MMF。データキュレーション: LMI、EYSK、BWR; 調査: BWR、LMI、EYSK、GJS。方法論: LMI、EYSK、BWR。プロジェクト管理: BWR、BMMA、EBS、SRRJ、MMF; 監督: BWR、BMMA、EBS、SRRJ、MMF; 執筆 - 原案: BWR、EYSK、LMI。執筆 - レビューおよび編集: BWR、LMI、EYSK。 LAMP解析ソフトウェアの開発：SPTSとVHAR

ブルーナ・ウィンカート・ラダッツへの手紙。

著者らは、潜在的な競合利益とみなされる可能性がある以下の経済的利益/個人的関係を宣言します。 MVM Figueredo は Hi Technologies LTDA の CEO です。 SR Rogal Júnior は Hi Technologies LTDA の CTO です。 BMM Almeida は Hi Technologies LTDA の CMO です。他の著者は Hi Technologies LTDA で働いているか、働いていました。他の著者は競合する利益を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

ラダッツ、BW、キム、EYS、今村、LM 他遠隔診断のための強化された手順制御を備えた、SARS-CoV-2 アッセイ用に最適化された比色 RT-LAMP の開発。 Sci Rep 12、21424 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 9 月 13 日

受理日: 2022 年 12 月 6 日

公開日: 2022 年 12 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-25872-1

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

科学レポート (2023)

コメントを送信すると、利用規約とコミュニティガイドラインに従うことに同意したことになります。虐待的なもの、または当社の規約やガイドラインに準拠していないものを見つけた場合は、不適切としてフラグを立ててください。

前: 宇宙サラダと塩水次: 花の形質の表現型解析と精油プロファイリングにより、ダマスクローズ (Rosa damascena Mill.) のクローン選択にかなりのばらつきがあることが明らかになりました。

お問い合わせを送信

送信