ラクトバチルス・ガセリSF1183による腸上皮細胞増殖とアポトーシスの調節

May 13, 2023

Scientific Reports volume 12、記事番号: 20248 (2022) この記事を引用

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腸内細菌叢は、有益な分子の産生、上皮バリアの完全性の制御、宿主の細胞死と増殖の間のバランスの調節など、腸の恒常性に対してさまざまなプラスの効果を及ぼします。 共生細菌と腸細胞の間の相互作用はまだ十分に研究されていないため、分子レベルおよび細胞レベルでそのような相互作用に対処することが最も重要です。 我々は、腸上皮細胞のモデルとして選択されたHCT116細胞に対するラクトバチルス・ガセリSF1183によって分泌される分子の効果のin vitro分析を報告する。 SF1183 は、人間の健康なボランティアの回腸生検から分離された L.ガセリ菌株で、生体内で大腸炎の症状を予防することができます。 以前の発見を拡張して、我々は、SF1183によって分泌される生理活性分子が、細胞周期マーカー（p21WAF、p53、サイクリンD1）の変動を決定する可逆的な方法でHCT116細胞の増殖を減少させ、その結果、TNF-α誘導からHCT116細胞を保護することを示す。アポトーシス、上皮バリアの完全性の保護と組織恒常性の再構成に潜在的に関連する効果。 一貫して、SF1183 分泌分子は、TJ の主要成分であるオクルディンの細胞間接触部での動員を増加させ、バリア機能の強化を示唆しています。

腸内微生物叢は、動物宿主と共生関係を形成して共進化し、宿主の代謝の健康に貢献しました。 腸内細菌の相対的な分布は個人に固有であり、食事、年齢、運動、薬物使用、宿主の遺伝学によって一時的に変化するため、正常または健康な微生物叢を定義することが困難になります。 しかし、高い分類群の多様性、高い豊富さ、安定した微生物叢の機能コアは、健康な腸内微生物群集の特徴です1。 このような微生物組成の劇的な変化（腸内細菌叢異常）は、一般に炎症性腸疾患（IBD）と呼ばれる結腸炎症（UC、潰瘍性大腸炎、CD、慢性疾患）を含むさまざまな代謝障害や腸炎症性疾患の発症に関連しています。 IBD は、宿主細胞による炎症性サイトカイン (TNF-α、腫瘍壊死因子α、IFN-γ インターフェロン ガンマ) の異常な産生と、部分的にはアポトーシスの亢進による上皮完全性の破壊によって特徴付けられます。 これらの状態のバランスをとるために、一連の微生物叢を対象とした介入戦略が提案され、動物モデルで、また場合によっては人間の臨床試験でもテストされています。 これらには、(1) プレバイオティクス、微生物叢の一部のメンバーによって発酵されると腸のバリア機能の改善を引き起こす難消化性オリゴ糖 (イヌリンやオリゴフルクトースなど)、(2) プロバイオティクス、コロニーを形成する生細菌の経口投与が含まれます。腸は有益な健康効果を発揮します (3) シンバイオティクス、プレバイオティクスとさまざまなプロバイオティクス株の組み合わせ。 (4) ポストバイオティクス、低温殺菌プロバイオティクス、または微生物株の一部1。

一部の細菌にはサイトカイン発現に影響を与え、炎症を軽減し、腸管バリアの完全性を保護する能力があるため、プロバイオティクスの経口使用は現在非常によく受け入れられています2、3、4、5、6。 プロバイオティクスの使用は、多くの文化圏で一般的であり、健康に有益な効果があると考えられている、生きた細菌を含む伝統的な食品に由来しています。 これに関連したよく知られた例は、さまざまな伝統的な発酵食品7に含まれる乳酸菌と、枯草菌で発酵させた大豆をベースにした日本の伝統的な健康食品である納豆に含まれるバチルス属の芽胞形成菌です。 納豆およびさまざまな国で伝統的に使用されている同様の発酵食品8. ビフィズス菌、ラクトバチルス属、バチルス属、およびサッカロミセス属のいくつかの種は、商業的なプロバイオティクスとして長い間使用されてきました8,9。 さらに、Faecalibacterium prausnitzii10 や Akkermansia muciniphila11 など、他の腸内細菌も次世代プロバイオティクスとして提案されています。

腸細胞と細菌の間の相互作用を制御する分子機構は、場合によっては in vitro で研究されています。 例としては、インターロイキン 12 (IL-12) の産生を誘導することで免疫調節効果を持つ L. カゼイ シロタが挙げられます。 L. fermentum NCIMB 5221 は抗増殖効果があり、高インスリン血症、インスリン抵抗性、高コレステロール血症、および高トリグリセリド血症を調節します。 Saccharomyces cerevisiae var.boulardii は、免疫グロブリン A (IgA) の分泌を増加させ、上皮バリアの完全性を維持することにより、抗炎症作用と抗菌作用を発揮します12。 多くの場合、細菌によって高密度で放出されるコミュニケーション分子であるクオラムセンシング自己誘導物質は、直接または細菌遺伝子の制御を通じて宿主の応答を調節することが示されています。 これに関連した例としては、腸細胞に取り込まれ、真核細胞の恒常性を活性化する生存経路 (p38 MitogenActivated ProteinKinase (MAPK) およびプロテインキナーゼ B) に寄与する、さまざまなバチルス種のクオラムセンシングペプチドがあります 13,14。 場合によっては、分泌される細菌エフェクターが同定されていないこともあります。L. ロイテリによって分泌される分子は、核因子 kB (NF-kB) の活性化を抑制することにより、骨髄性白血病由来細胞における腫瘍壊死因子 (TNFα) 誘導性のアポトーシスを増強することが判明しました。 IkBa分解を阻害し、核因子kB（NF-kB）依存性遺伝子産物を下方制御し、c-Jun N末端キナーゼやp38 MAPK15などのMAPK活性を増強することによりアポトーシスを促進します。

これに関連して、我々の研究は、L.ガセリ菌株によって産生および分泌される生理活性分子の結腸直腸HCT116細胞に対するin vitro効果を、分子レベルと細胞レベルの両方で調査する。 L.ガセリは、人間の腸の主要なホモ発酵性乳酸菌種の 1 つであり、SF1183 株は人間の健康なボランティアの回腸生検から分離されました 16。 特に、上皮細胞と密接に関連する細菌の亜集団から単離され、一連の腸内病原体に対して抗菌活性を有し、標準的な実験室および模擬腸内条件においてバイオフィルムを形成することが示されました 16。 私たちの以前の in vivo 研究では、SF1183 が腸の上皮に対して保護効果を持ち、腸​​の全体的な微生物組成に大きな影響を与えることなく密着結合を強化し、デキストラン硫酸ナトリウム誘発 (DSS) 誘発性大腸炎の症状を予防することが示されました 17。

我々はここで、L.ガセリSF1183が可逆的に細胞増殖に影響を及ぼし、TNF-α誘導性アポトーシスを減少させ、細胞周縁部でのオクルディン動員を増加させることにより、HCT116恒常性に影響を与えることができるというさらなる証拠を提供する。 我々は、細胞増殖マーカーの変化とバリア機能の強化を強く示す細胞形状の変化を示す分子および細胞レベルでの効果を特徴付けました。

サイトカイン誘導性アポトーシスに対する L.ガセリ SF1183 によって分泌される分子の影響を研究するために、TNF-α18 に対する感受性を考慮して HCT116 腸上皮細胞株を選択しました。 実験条件を設定するために、異なる濃度の TNF-α と異なるインキュベーション時間を使用して HCT116 細胞を処理しました (図 1)。 アポトーシス プログラムの誘導は、PARP-1 (ポリ ADP リボース ポリメラーゼ 1) のタンパク質分解切断の分析を通じて監視されました。 特に、ウェスタンブロットによるカスパーゼ 3 活性に起因する PARP-1 (89 kDa) 触媒サブユニットの検出は、実験設定においてアポトーシス マーカーとして使用されました。 予想通り、HCT116 細胞は用量と時間に依存して TNFα に応答しました (図 1)。 １ｎＭ ＴＮＦ－α、８時間のインキュベーション条件は、部分的なＰＡＲＰ－１切断を決定し、したがってアポトーシスレベルの増加または減少の検出を可能にするため、その後の実験のために選択された。

HCT116 細胞は TNF-α 誘導性アポトーシスに応答します (A) HCT116 細胞を、示された濃度の TNF-α とともに 8 時間インキュベートしました。 細胞を収集し、全タンパク質抽出物を、切断されたPARP-1およびβ-アクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。 (B) HCT116 細胞を 1 nM の TNF-α とともに 1、4、または 8 時間インキュベートしました。 細胞を収集し、全タンパク質抽出物を、切断されたPARP-1およびβ-アクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。

その後の分析用の馴化培地 (CM) を得るために、L. ガセリ SF1183 を定常期まで増殖させ、培地をろ過滅菌し、HCT116 細胞に (20% v/v) 16 時間添加しました。 その後、CMを除去せずに、細胞を1 nM TNF-αとともに8時間インキュベートするか（図2、レーン2および4）、またはインキュベートしません（図2、レーン1および3）。 インキュベーション時間の終わりに細胞を収集し、全細胞タンパク質抽出物を調製し、切断された89 kDa PARP-1 (Cell Signaling) に特異的な抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析しました。 図2に示すように、PARP-1のタンパク質分解性切断（未処理細胞で検出可能、レーン1を参照）は、TNF-α処理によって増加し（レーン1対3）、両方の細胞においてCMの存在下で大幅に減少しました。 TNF-αで処理したかどうか（レーン1対2および3対4；p = 0.0002、p < 0.0001）。 TNF-αで処理されなかった細胞におけるアポトーシスの減少は注目に値し、アポトーシスが基底レベルで起こる生理学的増殖条件下でも、L.ガセリのCMに存在する分子の抗アポトーシス効果を示唆している（図2、レーン） 1 対 2)。 HCT116細胞を乳酸でpH4.0に酸性化した新鮮な細菌培地で処理した場合、アポトーシスの減少は観察されず、CMで観察された効果がL.の発酵増殖によって引き起こされる培地の酸性化による可能性は排除された。ガセリ（データは示されていない）。

L.ガセリSF1183の馴化培地は、HCT116細胞のアポトーシスを減少させます。 (A) HCT116 細胞は、示されている場合、CM とともに 16 時間インキュベートしたか、またはしませんでした。 その後、示されている場合、細胞を TNF-α 1 nM とともにさらに 8 時間インキュベートしました。 細胞を収集し、切断されたPARP-1およびβ-アクチンに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって抽出物を分析しました。 (B) ImageLab によって実行された 3 つの独立した複製からの正規化された切断された PARP-1 レベルの定量化。 統計分析は、対応のない t 検定によって実行されました。 有意水準が示されています (***p = 0.0002、**** p < 0.0001)。

CMによって発揮される抗アポトーシス効果は、現在特徴付けが進行中の3 kDaより小さいタンパク質性分子によるものでした（補足図1）。

L.ガセリSF1183のCMがHCT116細胞に及ぼす効果を特徴付けるために、CMの存在下で24時間増殖させたHCT116細胞の生存率を分析するMTTアッセイを実施しました。 図 3A に示すように、CM は細胞生存率の 30% 減少を引き起こしました (p < 0.0001)。 MTT 実験に使用したのと同じ条件で測定した HCT116 細胞数の評価でも同様の減少が観察されました (図 3B; p < 0.0001)。これは、生存率の減少が細胞数の減少によるものであることを示唆しています。代謝活性ではなく、L.ガセリのCMにはHCT116細胞の増殖を阻害できる分子が含まれているという仮説が立てられる。 このような仮説を検証するために、細胞増殖のバイオマーカーのウェスタンブロット分析が実行されました。 CM とともに 24 時間インキュベートした細胞において、細胞周期停止マーカー p53 および p21WAF の劇的な誘導 (それぞれ約 2.5 倍および 8 倍増加; 0.00482; p = 0.0088) と細胞増殖マーカー (サイクリン D1) の減少が観察されました (図 3)、私たちの仮説を完全に裏付けています。

L.ガセリSF1183の馴化培地は、HCT116細胞の増殖を減少させます。 (A) 増殖中の HCT116 細胞を、CM (20% v/v) を添加または添加しない完全細胞培地中で 16 時間インキュベートしました。 その後、細胞をCMから洗い流し、MTTアッセイのために処理しました。 統計分析は、対応のない t 検定を使用して実行されました。 発現点間の有意水準が示されています (**** p < 0.0001)。 (B) 増殖中の HCT116 細胞を、CM (20% v/v) を添加または添加しない完全細胞培地中で 16 時間インキュベートしました。 その後、細胞をCMから洗い流した。24時間後、細胞を収集し、計数した。 発現点間の有意水準が示されています (**** p < 0.0001)。 (C) 増殖中の HCT116 細胞を、示されている場合、CM を補充した完全細胞培養培地中で 16 時間インキュベートしました。 その後、細胞を収集し、全細胞抽出物を調製し、p53、p21、サイクリンD1、β-アクチンおよびGapdhに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。 (D) ImageLab によって実行された 3 つの独立した複製からの正規化されたタンパク質レベルの定量化 対応のない t 検定を使用して統計分析を実行しました。 発現点間の有意水準が示されています (* p = 0.00482; ** p = 0.0088)。

HCT116 細胞の増殖に対する CM の負の効果は部分的に可逆的でした。 図4Aに示すように、CMの存在下で16時間増殖させたHCT116細胞は細胞増殖停止（図4Aの黒四角）を経験しましたが、CMを除去し、細胞を洗浄して新鮮な培地（黒四角）に再懸濁すると部分的に逆転しました。図 4A の三角形) (p < 0.0001)。 ＣＭ除去による細胞増殖の部分的な回復は、ＣＭ処理によって誘発されたｐ５３およびｐ２１ＷＡＦの細胞内レベルの減少によって確認された（図４Ｂ）。 まとめると、図４の結果は、L.ガセリSF1183のCMがHCT116細胞増殖に対して可逆的な効果を有することを示している。

L.ガセリSF1183の馴化培地は、可逆的にHCT116の増殖に影響を与えます。 (A) 完全培地 (対照、丸) または CM を補充した培地 (四角) で増殖させた HCT116 細胞の増殖曲線。 細胞はCMの存在下でも16時間増殖させました。 その後、細胞をCMから洗い流し、24時間および合計48時間まで増殖させた(三角形の曲線)。 統計分析は、二元配置分散分析およびトルコの多重比較検定を使用して実行されました。 有意水準 (**** p < 0.0001)。 (B) 24 時間の増殖時に細胞のアリコートを収集し、全タンパク質抽出物を p53、p21、および Gapdh に対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。 バンド強度は各ブロットの Gapdh で正規化し、コントロールに対する比として表しました。

細胞骨格要素は細胞間および細胞と基質の接着の形成に影響を与えるため、健康な胃腸バリアの形成に重要な役割を果たしており、その機能は栄養素の吸収だけでなく、病原体や炎症からの保護にも関連しています。 適切に機能するには、腸上皮が無傷の細胞層と、隣接する細胞間の空間を密閉する接合部で構成されている必要があります。 L.ガセリSF1183が生体内で密着結合に作用することが以前に報告されている17。 したがって、細胞間接触へのオクルディンの動員を分析するCMによって発揮される潜在的なバリア機能を特徴付けることにしました。 オクルディンは、構造の完全性とバリア機能の維持に関与する密着結合に富む内在性膜タンパク質です。 CM インキュベーション時に免疫蛍光 (IF) 実験を実行しました (図 5)。 細胞を一晩カバースリップ上に接着させ、通常どおりCMで16時間処理し、固定し、抗オクルディンによるIFに供し、続いてDAPIで核を対比染色した。 興味深いことに、処理された細胞の細胞間接触へのオクルディンの明らかな動員が観察されました（図5A、上部パネルと下部パネルを比較）。 興味深いことに、細胞形態の劇的な変化が治療により明らかになり、細胞間の密着結合の強化がさらに示唆されます。 注目すべきことに、図5Bに示すように、総オクルディンタンパク質レベルはCM処理によって増加しなかったため、L.ガセリの増殖中に分泌された分子が細胞周囲へのオクルディンの再局在化によって引き起こされるバリア機能の強化を誘導するという仮説を裏付けています。 この観察により、アポトーシスの保護は、L.ガセリの増殖中に分泌される分子によって引き起こされるバリア機能の強化によるものである可能性があるという仮説が生ま​​れました。

L.ガセリSF1183の馴化培地はHCT116に影響を与え、HCT116細胞に対してより広範な保護効果を発揮します。 (A) HCT116 細胞をカバースリップ上に播種し、示されている場合は CM で 16 時間処理しました。 細胞を固定し、抗オクルディンを用いたIFにより分析し、続いてDAPIにより核を対比染色した。 代表的な画像は Zeiss 共焦点顕微鏡で撮影されました。 スケールバーは5μm。 (B) HCT116 細胞を 20%v/v CM とともに 16 時間インキュベートしました。 細胞を収集し、抽出物をオクルディンおよびGapdhに対する抗体を用いたウェスタンブロットによって分析しました。

細胞死と増殖のバランスは、組織の健康、特に腸上皮などの高い細胞再生率を特徴とする組織の健康に関与する最も重要な恒常性メカニズムの 1 つです。 この点において、ラクトバチルス属やビフィドバクテリウム属などのプロバイオティクス細菌は、炎症の調節、酸化ストレスの軽減、細胞増殖の制御など、重要な役割を果たしています19、20、21、22、23。 特に興味深いのは、UC (潰瘍性大腸炎) や CD (慢性疾患) を含む、IBD (炎症性腸疾患) として知られる腸の炎症性疾患における共生細菌の関与です。 場合によっては、プロバイオティクスは、炎症性サイトカインのレベルに影響を与えることによって炎症性疾患の寛解を引き起こし、腸のバリアに保護効果を発揮することが示されています2,3,4,5,6,23。炎症とは、炎症性サイトカインの増加であり、腸管関門の破壊を伴う上皮細胞のアポトーシスを引き起こします。 一方、上皮の完全性が失われると、未消化の食物、有毒物質、細菌分子、微生物が粘膜下層に浸潤し、局所的な炎症がさらに増大し、全身的な影響も増大します。 これらの状態で最も多く産生されるサイトカインの 1 つは、炎症誘発性腫瘍壊死因子アルファ、TNF-α であり、細胞増殖とアポトーシスの間のバランスの制御に主要な役割を果たすことが知られています。 細胞の状態に応じて、TNF-α は細胞の生存または細胞死を媒介することができます 24。 抗 TNFα 治療 (コルチコステロイドおよび/またはモノクローナル抗体) による薬理学的介入は、IBD に対する潜在的な治療アプローチを構成します 24 が、ある程度の毒性が観察される可能性があります。 場合によっては、腸の炎症を治療するために、プロバイオティクスが単独で 25 または TNF-α に対する抗体と組み合わせて使用​​されています 26。 L.ガセリSF1183株がTNF-α誘導性アポトーシスから腸上皮細胞を保護できるという我々の観察は、これらのアプローチと一致している。 この株は健康な個人の腸に由来しており、腸への利益の基礎となっていることに注意する必要があります。 一方、L.ガセリは人間の健康に影響を与えることが知られている一般的なプロバイオティクス種です27。 さらに、SF1183 株は、DSS (デキストラン硫酸ナトリウム) 誘発大腸炎のマウスモデルにおいて、腸内微生物叢の組成を変化させることなく腸バリアの完全性を強化する保護効果を発揮できることが示されました 17。 SF1183株の有益な効果に関する証拠をさらに追加し、細胞レベルおよび分子レベルでの洞察を提供します。 L.ガセリによって分泌される分子は、p53/p21WAF経路に作用することにより、可逆的に細胞増殖を阻害します。 正確な分子機構は不明ですが、細胞周期停止の非常によく知られた調節因子である p21WAF の細胞内増加 28 は、HCT116 細胞に対する CM 効果の最終的なエフェクターを表す可能性があります。 一方、p21WAF は、さまざまな細胞機構によるアポトーシスの調節因子として重要な役割を果たすと思われる抗アポトーシス マーカーとも考えられています 29。 CM に関与する潜在的な生物活性分子に関する予備的な結果は、3 kDa より小さいタンパク質性の分子の存在を示しています。 このような代謝産物は、一度同定され単離されれば、健康に直接的な有益な効果をもたらし、ポストバイオティクスとして応用できる可能性があります 30。

興味深いことに、CM で処理した HCT116 細胞は細胞形状に劇的な変化を示し、細胞周縁部でのオクルディンの明らかな再局在化が見られ、これは細胞間密着結合の強化を示しています。 DSS 処置マウスへの L.gasseri SF1183 の経口投与が、未処置対照と同様に上皮表面にオクルディンの明瞭な染色を示し、上皮が再構成されていることを示すことを考慮すると、以前の in vivo 証拠はこの観察と一致しています。 私たちの分析は完全に異なる条件（L.ガセリ馴化培地、つまり分泌された潜在的な生物活性分子とともにインキュベートした培養ヒト細胞）で実施されましたが、現在の結果は以前にin vivoで得られた結果と一致しています。 興味深いことに、私たちの条件では、CMとのインキュベーションはオクルディンレベルの増加を引き起こさず、代わりに細胞間接触への再局在化を引き起こしました。

分泌分子の分子的性質、および観察された効果に関与する分子経路の詳細は、今後の課題となるでしょう。 これらすべての観察は、ヒト細胞に及ぼされる効果の可逆性と合わせて、L.ガセリSF1183が腸の炎症状態を改善するための安全で有望な治療ツールであることを強く示しています。

SF1183 ラクトバチルス・ガセリ菌株を MRS ブロス (Difco、デトロイト、ミシガン州、米国) で 24 時間 37 °C で増殖させ、希釈した培養物を最少規定培地 (MDM; グルコース 10 g/L、酢酸ナトリウム 5 g/L) に接種しました。 L、KH2PO4 3 g/L、K2HPO4 3 g/L、MgSO4 *7H2O 0.2 g/L、l-アラニン 100 mg/L、l-アルギニン 100 mg/L、l-アスパラギン酸 200 mg/L、l-システイン200 mg/L、l-グルタミン酸 200 mg/L、l-ヒスチジン 100 mg/L、l-イソロイシン 100 mg/L、l-ロイシン 100 mg/L、l-リジン 100 mg/L、l-メチオニン 100 mg/L L、l-フェニルアラニン 100 mg/L、l-セリン 100 mg/L、l-トリプトファン 100 mg/L、l-チロシン 100 mg/L、l-バリン 100 mg/L、ニコチン酸 1 mg/L、パントテン酸 1 mg /L、ピリドキサール 2 mg/L、リボフラビン 1 mg/L、シアノコバラミン 1 mg/L、アデニン 10 mg/L、グアニン 10 mg/L、ウラシル 10 mg/L)。 次に、SF1183 の細胞を 37 °C で 48 時間嫌気的に増殖させました。 培養物を遠心分離し（5000g、室温（RT）で10分間）、上清（馴化培地、CM）を0.22μmの低タンパク質結合フィルター（Millipore、ベッドフォード、マサチューセッツ州、米国）を通して濾過滅菌した。

ヒト結腸 HCT116 (ATCC CCL-247) は、Marina De Rosa 教授から寄贈されたもので、10%(v /v) FBS (ユーロクローン)、1% ペニシリン-ストレプトマイシン (ユーロクローン)、1% L-グルタミン (ユーロクローン)。 細菌 CM を完全 RPMI 増殖培地中で 10% および 20% v/v 濃度で 16 時間試験しました。 後者の濃度は、PARP-1 切断の減少においてより明確な結果をもたらし、以降のすべての実験に選択されました。 ＭＤＭ（細菌増殖培地）を、対照サンプル用の完全増殖培地中２０％ｖ／ｖ濃度で使用した。 示されている場合、CMを除去せずにTNF-α(1nM)(Millipore、イタリア、ミラノ)を細胞に添加し、8時間の処理後に細胞を回収した。

細胞生存率は、MTT アッセイ (Sigma-Aldrich) を使用して評価しました。 これは、ミトコンドリア デヒドロゲナーゼによる 3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウム ブロミド (MTT) のテトラゾリウム環の還元に基づいており、測定可能な紫色の色素 (ホルマザン) が得られます。分光測光的に; 生成されるホルマザンの量は生存細胞の数に比例します31。 HCT116 細胞を 96 ウェルプレートに播種しました (9 × 103 細胞/ウェル)。 次に細胞を記載どおり20% v/v CMで処理し、フェノールレッドを含まないDMEMで希釈した1×MTT溶液とともに37℃で3時間インキュベートしました。 上清を除去し、酸性イソプロパノール０．０１Ｎを各ウェルに添加して、形成された不溶性ホルマザン結晶を溶解した。 サンプルの吸光度は、マイクロプレートリーダー (Multiskan spectrum、Thermo)32 を使用して 570 nm で測定されました。

細胞増殖分析のために、HCT116 細胞を 2.5 × 105 細胞/ウェルの密度で 6 ウェルプレートに播種し、20% v/v の存在下で 24 時間インキュベートしました。 24 時間のインキュベーション後、細胞を収集し、各実験ポイントの細胞数を Scepter-Millipore カウンター (ハンドヘルド自動細胞カウンター) で計数しました。

ウェスタンブロット分析では、細胞を溶解バッファーで収集し、記載されているように処理しました 33。 次いで、製造業者の指示に従って、ミニトランスブロット装置（Bio-Rad）を使用して、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜（PVDF、Millipore）に転写した。 次いで、膜を指定の抗体とともにインキュベートした。 一次抗体は、抗ウサギ切断型 PARP-1 (Cell signaling EuroClone、ミラノ、イタリア 95415-S)、抗ウサギ p21WAF1 (Thermo Fisher、Invitrogen、Thermo Fisher Italy 14-671581)、抗ウサギ サイクリン D1 (SP4、Invitrogen) でした。 、サーモフィッシャー イタリア、MA5-16356) 抗マウス β-アクチン (C4 サンタクルーズ バイオテクノロジー DBA ミラノ、イタリア SC-47778)、抗マウス Gapdh (6C5 サンタクルーズ バイオテクノロジー DBA ミラノ、イタリア、SC-32233)、抗マウス p53 (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan MABE327)。 二次抗体は、抗ウサギ HRP (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan Italy 12-348) および抗マウス (Sigma Aldrich Merck Millipore Milan Italy A9044) でした。 タンパク質は、増強された化学発光（ECL、Bio-Rad）によって視覚化され、ChemiDoc TM XRS システム（Bio-Rad）の quantity One ソフトウェアによって明らかにされました。 バンド強度はImageLab BioRadソフトウェアによって定量化され、ローディングコントロールに関して正規化され、コントロールサンプルに対する増加/減少倍数として報告されました。 各ブロットの代表的な実験を示します。

元のブロットは不要なサンプルを除去するためにトリミングされており、補足情報の生データとして示されています。

IF実験では、細胞を24ウェルプレートに105細胞/ウェルでプレーティングし、CM 20% v/vで16時間処理し、34、35、36に記載されているように処理した。 簡単に説明すると、細胞をパラホルムアルデヒド (PFA) 3.7% で固定し、PBS 1× Tween 0.05% 中で抗オクルディン抗体 (Invitrogen Thermo Fisher OC-3F10) 1:250 とインキュベートし、続いて抗マウス Cy3 結合二次抗体 (Invitrogen Thermo Fisher) とインキュベートしました。 Alexa Fluor 色素 488) 1:500、PBS 1× Tween 0.05%。 画像は、Zeiss (オーバーコッヘン、ドイツ) の共焦点レーザー走査型顕微鏡 Axio Observer で撮影されました。 40 倍の対物レンズを使用し、ImageJ34 を使用して画像解析を実行しました。

すべてのデータは、少なくとも 3 つの生物学的複製の平均値 ± 標準誤差 (SE) として表されます。 分散分析は、一元配置分散分析または両側対応のない t 検定を使用して実行されました。 統計分析は、Graph-Pad Prism (Graph-Pad Software) を使用して実行されました。

この研究で提示されたデータは、本文、図、および補足資料で入手できます。

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この研究は、フェデリコ 2 世ナポリ大学 (Funds MUR Ministero Università Ricerca-FRA Finanziamento della Ricerca di Ateneo 2021) および AP および ER への部門研究基金 2021 から資金提供を受けました。

イタリア、ナポリのフェデリコ 2 世大学生物学部

ブランダ・ディ・ルッチャ、ヴィットリア・アカンポーラ、アネラ・サゲセ、ヴィオラ・カラブロ、マリア・ヴィヴォ、ティツィアーナ・アングリサーノ、エツィオ・リッカ、アレッサンドラ・ポリチェ

フェデリコ 2 世大学、分子医学および医療バイオテクノロジー学部、ナポリ、イタリア

ロレダナ・バッシガルピ

化学生物学科 A. ザンベリ、サレルノ大学、サレルノ、イタリア

マリア・ヴィヴォ

スタンフォード大学医学部微生物学および免疫学部、スタンフォード、カリフォルニア州、米国

ブランダ ディ ルッチャ

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BdL、VA、AS がほとんどの実験を実施しました。 BdLとASがCM制作に貢献。 MV は IF 実験と原稿の批判的な読解に貢献しました。 VC と TA は、設計実験、議論、原稿の批判的な読み取りに貢献しました。 LB は議論、提案、原稿執筆に貢献しました。 AP と ER は実験を設計し、プロジェクトを監督し、論文を執筆しました。 著者全員が最終原稿を読んで承認しました。

Ezio Ricca または Alessandra Pollice への通信。

著者の一人（E. Ricca）は、プロバイオティクス菌株の商品化に関して、Synergia Life Sciences（インド）のコンサルタントを務めています。 Synergia Life Sciences (インド) は、この研究で使用された菌株 (ラクトバチルス・ガセリ SF1183) の商業権を取得しましたが、研究の設計、データの収集、分析、解釈、または原稿の執筆には何の役割も果たしていませんでした。他のすべての著者は利益相反を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Di Luccia、B.、Acampora、V.、Saggese、A. 他。 ラクトバチルス・ガセリSF1183による腸上皮細胞の増殖とアポトーシスの調節。 Sci Rep 12、20248 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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受信日: 2022 年 8 月 24 日

受理日: 2022 年 11 月 16 日

公開日: 2022 年 11 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-24483-0

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