アミロイドの脳血管蓄積に関連する Aβ 排出障害と炎症

Apr 07, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 2 (2023) この記事を引用

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メトリクスの詳細

脳のβ-アミロイド（Aβ）除去の血管経路の障害は、アルツハイマー病（AD）の一因となります。血管損傷は一般的に糖尿病に関連しています。今回我々は、ヒト組織とADモデルラットにおいて、膵臓から分泌される血液由来の膵島アミロイドポリペプチド（アミリン）が脳のAβクリアランスを混乱させることを示す。血中アミリン濃度は、認知機能に影響を受けていない人よりもアルツハイマー病の方が高くなります。アミロイドを形成するアミリンは循環単球に蓄積し、脳微小血管内に Aβ と共沈着し、炎症を伴う可能性があります。ラットでは、アミロイドを形成するヒトアミリンの膵臓での発現は、実際に脳血管炎症とアミリン-Aβの共沈着を誘発します。血管周囲空間における Aβ の沈着によって示されるように、血液脳関門を通過する LRP1 媒介 Aβ 輸送と、血管壁に沿った間質液排出による Aβ クリアランスが損なわれます。分子レベルでは、脳血管アミリン沈着は免疫および低酸素関連の脳遺伝子発現を変化させます。ヒトと実験動物から得られたこれらの収束データは、血液由来のアミリンを変更すると、脳血管のアミリン沈着と Aβ 病理を潜在的に軽減できる可能性があることを示唆しています。

アルツハイマー病（AD）は、Aβ の過剰発現および/またはクリアランス障害を特徴とし、これは、Aβ 病理に対する早期発症の遺伝的素因に関連している可能性（家族性 AD）、または年齢とともに散発的に発生する（散発性 AD）1 可能性があります。 Aβ の効果的な除去と蓄積のバランスをとる要因は完全には定義されていません。脳内 Aβ クリアランスの確立された経路には、脳血管壁に沿った間質液の排出、血液脳関門 (BBB) を通過する輸送、ミクログリアおよび血管周囲マクロファージによる代謝が含まれます 2,3,4。

アミリン (膵島アミロイドポリペプチドとしても知られる) は、インスリンと同時放出される膵臓 β 細胞ホルモン 5 であり、BBB6 を通過し、満腹感の中枢制御に関与しています 7。 2 型糖尿病 (2 型 DM) 患者では、アミリンが膵臓アミロイド 8,9,10 (剖検時の有病率 >95%)10 を形成し、膵臓炎症と関連しています 11,12,13。さまざまな研究チームからのデータは、アミリンが、散発性および家族性 AD の両方の状況において、脳実質組織内で Aβ と相乗的に共凝集し、脳細動脈および毛細血管内にも沈着することを示しています 14,15,16,17,18,19,20,21 、22、23、24。中枢神経系における膵臓由来アミリンの濃度が高いと、認知障害の頻度の増加と関連しています21、22、23、24。 APPswe/PS1dE9 (APP/PS1) ラットでは、ヒトアミリン (げっ歯類のアミリンは非アミロイド生成性) の膵臓発現により、行動障害と脳 Aβ 沈着が促進されます 21。 Aβ 病態のないラット (HIP ラット) では、アミロイド形成ヒトアミリンの膵臓発現により、脳血管アミリン沈着が促進され、神経炎症 18,25,26 および神経障害 18,21,25 が引き起こされます。これらのデータは、血中のアミロイド形成アミリン濃度の増加が脳血管アミリン沈着を促進し、アルツハイマー病における血管周囲の炎症とAβクリアランスの混乱の重要な寄与因子であるという我々の仮説の基礎を形成しています。血中の膵臓由来アミリンと脳 Aβ クリアランス障害との潜在的な関連性を調べるために、AD 型認知症患者と認知障害のない人の血中アミリン濃度を測定し、脳実質および血管 Aβ との関係を評価しました。メカニズムを理解し、脳 Aβ 病変の発症を軽減/予防するための新しい治療標的を明らかにするために、我々は、膵臓にアミロイド形成ヒトアミリンを発現するトランスジェニックラットと、内因性の非アミリンを発現する対照ラットの脳 Aβ クリアランス経路の病態生理学的比較を実施しました。 -アミロイド生成性ラットアミリン。この研究の結果は、血液由来のアミリンの変化が、脳血管のアミリン沈着とAβ病態を潜在的に軽減する治療戦略としてどのように使用できるかをより深く理解するのに役立つ可能性がある。

私たちの研究で検証された全体的な仮説とワークフローおよび方法を図 1a、b に図示します。 ELISAを使用して、認知障害のない個人（CU; n = 42）およびsAD型認知症の人（DEM; n = 19）または軽度認知障害のある人（MCI; n = 19）から採取した血液サンプル中のアミリン濃度を測定しました（表を参照） 1 は年齢と性別の概要統計です)。各グループの血糖濃度（112.9 ± 5.71 mg/dL vs. 119.1 ± 9.43 mg/dL vs. 113.2 ± 5.10 mg/dL; 一元配置分散分析、P = 0.79）および年齢（79.35 ± 2.18 歳 vs. 81.35 ± 1.78 年 vs. 77.60 ± 0.66 年、一元配置分散分析、P = 0.14)。血中アミリン濃度の記述統計を補足図S1aに示します。血中アミリン濃度は、DEM 群と CU 群の方が高かった（図 1c）（Kruskal-Wallis 一元配置分散分析、P < 0.001）。 2 型 DM 状態に基づいて分割されたグループでは、血中アミリン濃度は非常に変動しており (補足図 S1b)、これは抗糖尿病薬の効果を反映している可能性があります。血中アミリン濃度の上昇と糖尿病との間の潜在的な関連性は、図1cと同じ血液サンプル中のアミリン-インスリンの関係を測定することによってさらに評価されました。インスリンおよびアミリンELISAは、血中インスリン濃度の増加が血中アミリン濃度の増加と関連していることを示しています（r = 0.52; P < 0.0001）（図1dおよび補足図S1c）。ペアワイズ相関係数は、アルツハイマー病において高アミリン血症と高インスリン血症が相関していることを示しています。

推定上のアミリン機能 (緑のパネル) と病理 (赤のパネル) (a)、およびワークフローと方法 (b)。 c 認知症（DEM; n = 19）、軽度認知障害（MCI; n = 19）、および認知障害のない人（CU; n = 42）の血中アミリン濃度。 d (c)と同じ血液サンプル中のアミリン濃度とインスリン濃度の間のペアワイズ相関係数(r)。 e アミリン陽性 (Q2) または陰性 (Q1) の血液中の循環 CD14+ 単球のフローサイトメトリーによる、アミリン濃度の下位四分位と上位四分位の比較。 f CD14+ 単球に取り込まれたアミリンを示す共焦点顕微鏡画像 (n = 3)。 sAD患者（n = 42）とAD非罹患者（n = 18）を含むヒトの脳におけるアミリンとAβ42濃度の間のペアワイズ相関係数（r）（g）、および一致する生前血漿アミリン濃度と剖検脳組織中のアミリン濃度の間、sADのある人（n = 12）とADのない人（n = 8）の個人（h）を含みます（潜在的な外れ値は分析から削除されました;補足図S1eに示されています）。 i sAD 脳からの連続切片に対する抗アミリン (茶色) および抗 Aβ (緑色) 抗体を使用した IHC 分析 (n = 18)。 j sAD脳における血管アミリン-Aβ沈着を示す共焦点顕微鏡分析およびアミリン-Aβ近接ライゲーションアッセイ（PLA）。 fAD 脳の IHC 分析では、血管周囲腔および血管壁に Aβ が沈着し、内腔内にアミリンが蓄積 (k、l)、血管壁 (m) または血管壁 (n) にアミリンが沈着し、血管周囲腔に Aβ が沈着していることが示されています ( n = 32)。データはボックスアンドウィスカーまたは相関分析として表示されます。クラスカル・ウォリス一元配置分散、データは平均値 ± SEM。

アミロイド形成アミリンの分泌の増加は、膵島内のマクロファージおよび樹状細胞におけるアミリンの蓄積を促進するため、我々は、慢性的に上昇した血中アミリンレベルが全身性炎症を引き起こすという仮説を立てた。フローサイトメトリーを使用して、アミリン陽性の循環 CD14+ 単球の画分を分類しました。アミリン濃度が上位 4 分位 (>3.5 pM) の血液サンプルと、アミリン濃度が下位 4 分位 (<1.5 pM) の血液サンプルにおけるアミリン陽性の循環単球 (Q2) とアミリン陰性の循環単球 (Q1) の画分を定量しました。。アミリン濃度が上位 4 分の 1（>3.5 pM）の血液サンプルには、アミリン陽性の CD14+ 単球の割合が増加しました（Q2）（図 1e）。共焦点顕微鏡画像により、循環 CD14+ 単球におけるアミリン封入体が確認されました (図 1f)。

次に、血中アミリン濃度の上昇と、脳内のアミリンおよび Aβ 蓄積との関連性を明らかにすることを目的としました。 ELISAを使用して、十分に確立された神経病理学的特徴によって特定されたsAD患者27、28、29、30、31（n = 42、2型DM患者n = 22）および個人からの側頭皮質ホモジネート中のアミリンおよびAβ42の濃度を測定した。 sAD病理なし（n = 18; 2型DMのあるn = 6）（臨床データについては表2を参照）。 sAD 群と非 AD 群では、個人の年齢は類似しています (85.65 ± 7.04 歳 vs 87.22 ± 7.30 歳)。脳アミリン濃度は、対照群と比較して sAD 患者の方が高かった（対応のない t 検定、 P < 0.01）（補足図 S1d）。これは、他のコホートからの以前の結果と一致しています 15,21。 2型DMのある人とそうでない人の脳のアミリンレベルに差はありませんでした（補足図S1e）。しかし、この分析では、血糖降下薬の潜在的な影響や、認知障害を持つ個人に投与される薬剤については管理されていませんでした。脳アミリン濃度の増加は、Aβ42濃度の増加と関連しており（r = 0.34; P < 0.05）（図1g）、fAD脳で最近特定されたアミリン-Aβ42関係と一致しています21。このコホート（sADグループではn = 12、対照はn = 8）で入手可能な、対応する血漿および脳組織ホモジネートを使用して、生前の血漿アミリン濃度と剖検脳組織中のアミリン濃度の間の関係を評価しました。ペアワイズ相関係数は、循環アミリンレベルと脳内に蓄積するアミリンの傾向との間の関係の可能性を示唆しています（r = 0.40; P = 0.09）（図1h）（分析により、脳組織アミリン濃度の潜在的な外れ値が除外されました。補足図。Ｓ１ｅ）。適合する血漿サンプルと脳サンプルのサンプルサイズが小さいため、制限があります。

BBB におけるアミリンと Aβ の潜在的な重複をテストするために、免疫組織化学 (IHC)、共焦点顕微鏡、抗アミリンと近接ライゲーションアッセイ (PLA) を使用して、血管アミリンと Aβ の共局在の組織学的証拠について sAD 脳と fAD 脳を分析しました。抗Aβ抗体。 IHC画像上のアミリン免疫反応強度シグナルのデコンボリューションと分析では、2型DM患者の膵臓組織がアミリン沈着のポジティブコントロールとして機能しました（補足図S1f）。脳血管アミリン-Aβの共局在の組織病理学的分析を表3にまとめます。83歳の側頭皮質組織における抗アミリン、抗Aβ、および抗アミリンと抗Aβの組み合わせ抗体による連続切片およびIHC染色からの代表的な画像。 sAD および 2 型 DM を患う 1 歳の女性を図 1i に示します。共焦点顕微鏡分析と、同じ抗アミリン抗体および抗Aβ抗体を用いたPLAにより、脳血管アミリン-Aβ沈着がさらに確認されました（図1j）。 PLA シグナルは、細動脈壁内に現れるアミリン-Aβ の共局在と全体的に一致しています。比較のために、2型糖尿病ではない86歳の認知障害のない女性の側頭皮質組織のIHC分析の画像を補足図S1gに示します。図1k〜nおよび補足図では、Ｓ１ｈ、我々は、ＩＨＣおよびＥＬＩＳＡ２１によるアミリン蓄積が証明されたｆＡＤ患者の脳のサブセットにおけるＩＨＣ分析からの脳血管アミリン−Ａβ共局在の追加の例を提示する。 Aβの沈着は血管周囲腔および動脈壁に存在しますが、アミリンは内腔（図1k、l）、動脈壁（図1m）および内腔側（図1n）に蓄積しているようです。 IHC 分析により、fAD 脳の Aβ 染色陽性の全血管の約 2/3 でアミリンが検出されました (表 3)。抗アミリン、抗 Aβ、および抗 α 平滑筋細胞 (SMC) アクチン抗体で三重染色した脳切片の共焦点顕微鏡分析は、Aβ が血管周囲領域に存在し、アミリンが血管壁内に存在するという共局在パターンをさらに裏付けています。（補足図S1i）。

我々のデータは、アルツハイマー病患者において、血液および循環単球中に膵アミロイド形成アミリンが蓄積し、アミリンが脳血管内にAβと共局在していることを示している。この結果は、血液中のアミロイド形成アミリン濃度の増加が脳のAβ流出を乱し、おそらく炎症を伴うという仮説を示唆している。

我々は、膵臓β細胞がヒトアミリンを発現するラット（HIPラットモデル18）と、内因性の非アミロイド生成性ラットアミリンを発現する野生型（WT）ラットを使用して、膵臓におけるアミロイド形成ヒトアミリンの濃度増加の潜在的な原因効果を調べた。全身性および脳血管の炎症の発症に関する血液。以前に報告されたように、HIP ラットの膵臓におけるヒトアミリン RNA 発現の特異性と脳におけるヒトアミリン RNA の欠如は、qRT-PCR によって記録されました 25。雄および雌の HIP ラットは、膵臓アミリンアミロイド沈着 18,32 グルコース調節異常 18,32 および神経障害 18,25 に関連する 2 型 DM を発症します。以前に報告したように、HIP 雌ラットと雄ラットでは、グルコース調節異常と行動障害が遅れて (約 6 か月までに) 発症します 18。血中アミリン濃度は、血糖値が上昇すると増加します（図 2a）。 HIP ラットが神経障害を発症する年齢（約 16 か月）（補足図 S2）では、HIP 雄ラットの血中アミリン濃度は、認知機能低下のある人と同様の範囲内でした（図 2b）。

a 生後 6 ～ 8 か月 (n = 6)、生後 10 ～ 12 か月 (n = 13)、および生後 15 ～ 16 か月 (n = 12) の HIP ラットの断面血中アミリンおよびグルコース濃度。 b 認知症ヒト（DEM）とHIPラットの血中アミリン濃度。 (n = 16) (a) と同じラット。 c (b) と同じラットからの血液中のアミリン陽性の循環 CD14 + 単球のフローサイトメトリー分類 (n = 10 雄/グループ)。 d (b)と同じラットの血液中のCD14+（赤）およびアミリン（緑）について染色した循環単球の共焦点顕微鏡画像（n = 5血液サンプル/グループ）。 e (b)のグループと同様のHIP対WTラットからの血漿中のインターロイキン（IL）-1β ELISA（n = 10雄/グループ）。 f（b）で研究したラットの脳血管におけるIL-1βおよびアミリンの沈着を示す共焦点顕微鏡画像（n = 3雄/グループ）。 g (c) と同じグループの HIP ラットおよび WT ラットの脳切片の IHC 分析。アミリンの血管沈着物（茶色）およびアストログリア反応（グリア原線維酸性タンパク質の緑色の染色; GFAP）を示しています（n = 5 雄/グループ）。 (b) と同じグループの HIP 対 WT ラットの脳切片における貪食性ミクログリア (CD68) (h) および血管単球動員 (CD11b) (i) の IHC 分析 (n = 10 雄/グループ)。データは平均値 ± SEM です。すべてのパネルに対する対応のない t 検定。

フローサイトメトリーを使用して、WT同腹子の血液中と比較して、HIPラットの血液中により多くのCD14+単球およびアミリン陽性CD14+単球が存在することがわかりました（図2c）。 AD患者からのヒト血液と同様に（図1f）、CD14+について染色された循環単球の共焦点顕微鏡画像（アミリン沈着もある（図2d））。

膵臓のアミロイド形成アミリンは、マクロファージおよび樹状細胞の NLRP3 インフラマソームを活性化し、インターロイキン (IL)-1β の成熟と膵島炎症を引き起こします 11、12、13。血漿中の炎症誘発性サイトカインIL-1βの濃度は、WT同腹子よりもHIPラットの方が高かった（図2e）。これは、HIP ラット脳血管壁における IL-1β 免疫反応性シグナル強度の増加と関連しており（図 2f）、HIP ラット脳実質組織における IL-1β 分析からの以前に発表されたデータと一致していた 25,26。 IHCと抗アミリンおよび抗グリア線維酸性タンパク質（GFAP）抗体を使用して、HIPラット脳における脳血管アミリン誘発性アストログリア反応を検出しました（図2g）。これは、分化クラスター（CD）68およびCD11bに対する抗体を用いたIHCによって示唆されているように、単球およびマクロファージの血管動員に関連しているようです（図2h、i）。これらの結果は、膵臓から分泌されるアミロイド形成アミリンへの慢性的な曝露が、全身性および局所的な脳血管炎症の引き金となることを示しています。

血液溶解物中のチオフラビン T (ThT) 蛍光シグナル強度は、WT 同腹子よりも HIP ラットの方が高く (図 3a)、血液中のアミロイド形成アミリンの蓄積を示しています。 ELISAを使用して、16か月齢のWT同腹子からの脳微小血管溶解物と比較して、HIPラットの脳微小血管溶解物中のアミリン濃度が増加していることを発見しました（図3b）。 HIPラットおよびWTラットの脳切片を抗Aβ抗体および抗アミリン抗体で共染色すると、HIPラットの血管アミリンAβ沈着が検出されました（図3c）。 HIP ラットの脳では、アミリン免疫反応性が血管の内腔側で検出され、多くの場合、Aβ が血管周囲腔内に存在し、実質組織中に散在していました。

a HIP ラットおよび WT 同腹子 (15 ～ 16 か月齢、n = 10 雄/グループ) の血液溶解物におけるチオフラビン T (Th T) 蛍光シグナル強度。 b HIPラットおよびWTラットの脳微小血管溶解物中のアミリン濃度は、（a）のものと同様です（n = 10雄/グループ）。 c HIP ラット脳の IHC 分析。血管周囲腔内の Aβ 沈着 (緑色) と内腔内のアミリン蓄積 (茶色) を示します。 (n = 5 匹の男性/グループ、年齢 15 ～ 16 か月)。 d 生後15〜16か月のAPP / PS1 / HIPおよびAPP / PS1同腹子からの血液溶解物における平均チオフラビンT（Th T）蛍光シグナル強度（n = 10匹のラット雄/グループ）。 e 上記と同じラットの脳微小血管溶解物中のアミリン濃度。 f 抗アミリン（茶色）および抗Aβ（緑色）抗体で共染色したAPP / PS1 / HIPおよびAPP / PS1ラットの脳切片の代表的なIHC顕微鏡写真（n = 5匹の雄/グループ、年齢15〜16か月） ) (3 スライド/脳)。代表的な IHC 画像と、APP/PS1/HIP 対 APP/PS1 ラット雄の脳切片における貪食ミクログリア (CD68) (g) および血管単球動員 (CD11b) (h) の分析 (n = 10 雄/グループ; 年齢 16-)月）。データは平均値 ± SEM です。すべてのパネルに対する対応のない t 検定。

さらに、膵臓でヒトアミリンを発現するAPP/PS1ラット（APP/PS1/HIPラット）を使用して、AD様病状における脳血管Aβに対する膵臓アミロイド形成ヒトアミリンの影響を研究しました。 APP/PS1/HIP ラットは脳内にアミリン Aβ 沈着を生じます 21。 APP / PS1同腹子と比較して、APP / PS1 / HIPラットは血液溶解物中のTh-Tシグナル強度が増加し（図3d）、脳微小血管中のアミリン蓄積が増加しました（図3e）。抗Aβ（緑色）および抗アミリン（茶色）抗体を用いたIHCにより、APP/PS1/HIPラット脳におけるアミリン-Aβの血管組織領域の共局在が明らかになったのに対し、APP/PS1同腹子には脳血管内アミリン-Aβ沈着が見られなかった（図） .3f）。これは、CD68およびCD11bに対する抗体を用いたIHCによって示されるように、単球およびマクロファージの血管動員と関連しており（図3g、h）、HIPラットで実証された脳血管炎症と同様（図2h、i）。

我々の結果は、ヒトアミリンの膵臓特異的発現を有するラットにおける神経障害の晩年発症（補足図２）が、大脳細動脈におけるアミリン沈着（Aβとの共沈着を含む）と関連していることを示している（図３ｃ、ｆ）。毛細血管内（図2b、e）、全身性および脳血管炎症の発症を伴います（図2および3g、h）。これらの結果は、ヒトにおける我々の発見を再現しています (図 1)。

脳における間質液の排出障害は、血管周囲の Aβ 沈着物の存在によって示され (図 3c、f のように)、血管 SMC の収縮と弛緩の変化に起因すると考えられます 2,3,4。血管筋原性緊張のメディエーターである内皮の一酸化窒素 (NO)-アルギナーゼ恒常性 33 は、HIP ラットでは損なわれており、内皮機能不全に関連しています 34。我々は、脳血流（CBF）、圧筋図法、およびHIPラットとWTラットにおける血管SMC酸化ストレス実験を使用して、血液中のアミロイド形成アミリン濃度の増加と脳血管拡張の障害との間の可能性のある関連性を試験した。

縦方向の脳MRI測定により、HIPラットとWTラットでは加齢とともにより急速に進行する一貫した構造変化が明らかになりました（図4a）。脳灌流は、擬似連続動脈スピン標識 (ASL) を使用して評価されました 35。結果は、15〜16か月齢のHIPラットにおけるCBFの減少を示しています（図4b）。亜硝酸塩および硝酸塩（安定なNO最終生成物）の血漿濃度は、HIPラットとWTラット（15〜16か月）で増加しました（図4c）。これは、おそらくHIPラットの全身性炎症の結果です（図4のデータによって示唆されているように）。 2)。単離された軟膜動脈を使用した圧力筋造影実験は、WT 動脈と HIP 動脈の両方が動脈緊張 36 (例、圧力誘発性収縮) を発症することを示しています (図 4d)。ただし、HIPラットの動脈は、血管内圧の増加（たとえば、60〜100 mmHg）に伴い、WTラットと比較して動脈緊張の上昇を示します（図4d、e）。アミリン誘発性動脈緊張障害をさらに検証するために、WT ラットとアミリンノックアウト (AKO) ラット、およびアミリン免疫反応性シグナル強度を再現するレジメンでアミロイド形成ヒトアミリンを静脈内注射した AKO ラットから単離した大脳動脈を使用しました。ヒト血漿で測定18（すなわち、60 μg/kg 体重；尾静脈を介して 1 週間毎日 IV 注射）。動脈緊張は、WTラットとAKOラットの脳動脈で類似しています（図4f）。ただし、ヒトアミリンを注射したラットの動脈では動脈緊張が上昇しました（図4f）。これらの結果は、動脈緊張の低下に対するアミリンの直接的な影響を示唆しています。これらの結果と一致して、HIPラットの血管SMCでは脂質過酸化が増加しており（図4g、h）、これは外因性ヒトアミリンとインキュベートしたSMCでも発生します（補足図S3a、b）。

HIP 対 WT ラットにおける T2 強調 MRI および縦方向の心室高信号量（n = 4 ～ 5 雄/グループ）。 b 15〜16か月齢のHIPラットおよびWTラットにおけるCBFマップおよびグローバルCBF（雄9匹/グループ）。 c HIPラットおよびWTラットにおける血漿亜硝酸塩および硝酸塩の断面濃度（n = 6雄/グループ/年齢）。異なる血管内圧での HIP および WT ラット雄の軟膜動脈の直径トレース (d)、および示された血管内圧で測定された軟膜動脈の動脈緊張 (e) (2 ～ 3 動脈/ラット、n = 6 ～ 7 雄/グループ) 、生後15〜16か月）。 f WTラットおよびアミリンノックアウト（AKO）ラットの後大脳動脈、およびヒトアミリンを静脈内注射したAKOラットにおける（e）と同じ（n = 3雄/グループ、9〜10か月齢）。 g、h Liperfluo (g; N = 4 匹の WT ラットからの SMC 62 個および 4 匹の HIP ラットからの 70 細胞) および C11-BODIPY581/591 (h; N = 87) で測定した WT および糖尿病 HIP ラット雄の軟膜動脈 SMC における脂質過酸化7 匹の WT ラットからの SMC、および 4 匹の HIP ラットからの 68 個の細胞）。 i HIP 対 WT 脳微小血管溶解物中のアルギナーゼ活性およびアルギナーゼ 1 およびアルギナーゼ 2 濃度（n = 7 人の男性/グループ、年齢 15 ～ 16 か月）。 j 提案されたメカニズム：血液中の膵臓アミロイド形成アミリン濃度の慢性的増加は、血管壁内に酸化ストレスを引き起こし、NO-アルギナーゼ調節不全、SMC機能および筋原性緊張の障害を引き起こす。データは平均値 ± SEM です。パネル (g、h) についてはマン・ホイットニーノンパラメトリック検定、その他のパネルについては対応のない t 検定。

脂質過酸化の増加は、血管壁の酸化ストレスに寄与し、NO の生体利用効率を低下させ、血管拡張機能を変化させます。アルギナーゼ活性と発現の両方が、WT同腹子由来のものと比較してHIPラットからの脳微小血管溶解物において増加し（図4i）、アルギナーゼ-NO調節不全を示唆している（図4j;提案されたメカニズム）。脳血管アルギナーゼ-NO制御に対する血中アミリン濃度の上昇の考えられる影響は、アミロイド形成ヒトアミリンを静脈内注射したラットの脳微小血管溶解物でさらにテストされました（補足図S3c）。

まとめると、我々の結果は、HIPおよびAPP / PS1 / HIPラットの血管周囲Aβ沈着（図3c、f）が、アミリン血管障害の発症によって引き起こされる脳血管SMCの自発的収縮/弛緩の変化に潜在的に関連していることを示しています。

脳組織ホモジネートにおけるAβのウェスタンブロット分析（図5a）、および血漿および脳ホモジネートにおける免疫沈降による濃縮Aβのウェスタンブロット分析（図5b）は、遺伝的に誘導されたAβ過剰発現がない場合でも、HIPラットにおける脳Aβ沈着を示しています。 (すなわち、APP/PS1 ラットの場合と同様)。血漿対脳 Aβ レベルの比率は、WT ラットと比較して HIP で低く、脳から血液への Aβ 輸送の潜在的な障害を示唆しています。これらの実験では、脳内 Aβ 蓄積の陽性対照として、生後 12 か月の APP/PS1 ラットからの脳ホモジネートを使用しました。

WTおよびHIPラット（n = 4〜5匹の雄/グループ、15〜16ヶ月齢）の脳組織Aβのウェスタンブロット分析。ラットAβ40およびAPP / PS1ラット脳ホモジネートをAβ免疫反応性シグナルの陽性対照として使用した。 b WTおよびHIPラットの血漿および脳ホモジネート中のAβの免疫沈降およびウェスタンブロット分析による脳Aβ流出の推定（aと同様）。APP / PS1ラット脳ホモジネートをAβ免疫反応性シグナルのポジティブコントロールとして使用します。 c BBBを通過するAβ輸送に対する提案されたアミリン作用。 d HIP（n = 47微小血管）およびWT（n = 21微小血管）ラット（n = 3雄/グループ、15〜16ヶ月齢）から単離された脳微小血管におけるアミリンの共焦点顕微鏡法およびSTORM分析。チオフラビン S (チオ S) またはアミリン (e)、および脂質過酸化マーカー 4-HNE またはアミリン (f) で染色した HIP ラット脳からの連続切片の共焦点顕微鏡分析 (n = 3 雄、d と同様)。 HIPラットおよびWTラット（n = 5〜7匹の雄/グループ、aと同様）の脳微小血管溶解物、およびヒトアミリンとインキュベートした脳微小血管ECにおけるP-gp（g）およびLRP1（h）のウェスタンブロット分析。データは平均値 ± SEM です。

BBB を通過する Aβ 輸送は、アポリポタンパク質 E (APOE) 受容体である低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質 1 (LRP1) によって媒介されます 37、38、39。 BBBでは、LRP1は内皮の脳側でAβに結合し、体循環へのAβ放出を促進します（図5c）。 ATP 依存性の排出ポンプである P-糖タンパク質 1 (P-gp; ATP 結合カセットサブファミリー B メンバー 1; ABCB1 としても知られる) は、BBB の血液側での Aβ の放出を媒介します40,41。以前の研究で説明したように、ApoA-I は内皮細胞 (EC) の P-gp を安定化し 42,43、HIP ラットのアミリンに結合します 18。今回我々は、HIPラット脳微小血管系における脳血管アミリン沈着と、ECストレスを介したLRP1およびP-gpタンパク質発現の変化との関連を測定した。共焦点顕微鏡法と確率的光学再構成顕微鏡法（STORM）超解像度イメージングを使用したアミリン沈着の分析により、アミリンとカベオリン-1の光強度信号の並置が示され（図5d）、HIPラットの脳毛細血管におけるアミリン沈着が確認されました（図3bを参照））。脳毛細血管におけるアミリンの沈着はアミロイドの生化学的特性を持ち（図5e）、脂質過酸化マーカー4-ヒドロキシノネナール（4-HNE）の蓄積を引き起こし（図5f）、BBB内のアミリンアミロイド誘発酸化ストレスを示しています。これは、HIPラットおよびWTラットの脳毛細管溶解物およびアミロイド形成ヒトアミリンとインキュベートしたECの溶解物におけるこれらのタンパク質のウェスタンブロット分析によって示されるように、P-gpおよびLRP1タンパク質レベルの下方制御と関連していた（図5g、h）。。

アミロイド形成アミリンがLRP1によって媒介されるAβ流出に直接影響を与えるかどうかを判断するために、EC単層を管腔側でアミロイド形成ヒトアミリンに、管腔外（脳側）でAβに曝露するBBBのin vitroモデルを採用しました。）、図6aに示すように。 BBB モデルは、経内皮電気抵抗 (TEER) を測定することによって単層形成についてテストされました (図 6b)。すべての実験は、最大 TEER = 110 ± 5 Ω/cm2 を特徴とする完全に形成された EC 単層を使用して実行されました。様々な濃度のヒトアミリンとの24時間のインキュベーションに対する脳微小血管ECの用量反応を図6cに示します。 LRP1タンパク質レベルは、ヒトアミリンの濃度が増加すると減少しました。 LRP1発現は、10μMヒトアミリンとともにインキュベートしたECでは50％を超えて減少しました（図6c）。 EC生存率はヒトアミリンとのインキュベーションによって影響を受けず(図6d)、LRP1タンパク質発現の減少が細胞死によるものではないことを示している。次に、ヒトアミリンペプチド（10μM）またはビヒクルを管腔（血液）側に24時間適用した後、EC単層をPBSで洗浄し、FITC-デキストランまたはカルボキシフルオレセイン標識Aβ42（Aβ42-FAM）を管腔外（脳）に適用しました。 ) BBB 側に 1 時間放置します。単層を通過したAβ42-FAMおよびFITC-デキストランの量は、内腔側から収集された培地サンプルの蛍光強度から推定され、Aβトランスサイトーシス商を計算するために使用されました。アミリン前処理は、Aβトランスサイトーシス商を20±5%減少させた(P<0.05)(図6e)。

Aβトランスサイトーシス実験で使用されるインビトロBBBモデル（EC単層 - 管腔側チャンバー、星状細胞 - 反管腔側チャンバー）の漫画表示。 b 培養日数の関数としての EC 単層 (n = 20 調製物) における経内皮電気抵抗 (TEER)。 c ビヒクルまたはさまざまな濃度のヒトアミリン（500 nM、1 μM、5 μM、および10 μM）で24時間処理した初代ラット脳微小血管ECからのライセート中のLRP1の代表的なウェスタンブロットおよびデンシトメトリー定量（n = 3調製/テスト）。 d アミロイド形成ヒトアミリン（500 nM、1 μM、5 μM、および10 μM）またはビヒクルで24時間処理したECにおけるMTSアッセイからの細胞生存率パーセント。 e ビヒクルおよびヒトアミリン処理EC単層における、インビトロBBBを通過するAβ42トランスサイトーシス商(TQ)。 f ビヒクル、ヒトアミリンまたはラットアミリンで処理したECからの溶解物中のqRT-PCRで測定したLRP1 mRNAレベル（2-ΔΔCt法を使用した倍率差）。 g 図5hと同じラットの脳毛細管溶解物中のqRT-PCRによって測定されたLRP1 mRNAレベル。 h、i ビヒクルまたはヒトアミリンで処理したECからのライセート（図5hと同じ）、および図5と同じラットの脳毛細管ライセートにおけるqRT-PCRによって測定されたmiRNA（miR）-103およびmiR-107の発現レベル。 .5時間。 j miR-205、miR200bc-3p/429、miR-103、miR-107のコンセンサス領域を示すTargetScan概略図。 miRNA (miR) 103 および miR-107 で処理した EC の LRP1 と miR 対照 (n = 3 調製物/グループ) (k) のウェスタンブロット分析、およびantagomir (amiR) 103 および amiR-107 で処理した EC を、amiR コントロールで処理した細胞と比較しました (n = 3 調製物/グループ)。データは平均値 ± SEM です。ダネットのポストホック (F) を使用した一元配置分散分析。他のパネルに対する対応のない t 検定。

10μMのアミロイド形成ヒトアミリンと24時間インキュベートしたECでは、対照EC（ビヒクル処理）および同じ濃度のラットアミリンとインキュベートしたECと比較して、LRP1 mRNAレベルが上昇しました（図6f）。 LRP1 mRNAレベルは、HIPとWTの脳毛細管溶解物で増加しました（図6g）。総合すると、これらの結果は、アミロイド形成アミリンが転写後レベルで輸送タンパク質の発現を抑制することにより、Aβ 流出に直接影響を与える可能性があることを示しています。

公表されたデータは、パラログ miRNA miR-103 および miR-107 が酸化ストレスによって上方制御され 44、いくつかの細胞株において LRP1 翻訳を抑制することを示しています 45。したがって、我々は、miR-103 および miR-107 が微小血管 EC におけるアミリン誘導性の LRP1 ダウンレギュレーションに関与しているという仮説を立てました。 ECライセートからのRT-PCRデータが示すように、10μMのアミロイド形成ヒトアミリンと24時間インキュベートしたECは、miR-103およびmiR-107レベルの増加を示しました（図6h）。上記と同じHIPおよびWTラット毛細管溶解物を使用して（図6g）、HIP対WTラット毛細管でより高いmiR-103およびmiR-107レベルを検出しました（図6i）。これは、in vitroの結果と一致しています（図6i） .6時間）。 TargetScan は、miR-103 および miR-107 が LRP1 に直接結合すると予測します (図 6j)。したがって、miR-103 および miR-107 模倣物を微小血管 EC に同時トランスフェクトし、次に antagomir (amiR)-103 および amiR-107 を使用して miR-103 および miR-107 のアミリン誘導性上方制御を沈黙させました。我々の結果は、miR-103/107がLRP1を下方制御し（図6k）、アミロイド形成ヒトアミリンとのインキュベーションの効果を再現することを示しています（図5h）。 AmiR-103/107は、アミリン誘発細胞ストレス後のECにおけるLRP1発現をレスキューする(10μMヒトアミリンとの共インキュベーション)(図6l)。しかし、amiR-103/107はP-gp発現をレスキューしません(図6m)。

総合すると、我々の結果（図2～6）は、慢性的に調節不全となっている膵臓アミリンと、以下のメカニズムを介した脳から全身循環へのラットAβ流出障害との間に潜在的な関連性があることを示唆している： 1、アミリン血管障害は、脳血管拡張の減少と間質性アミリンの変化を引き起こす。脳血管の壁に沿った体液の排出。 2、BBB での P-gp および LRP1 のダウンレギュレーションを引き起こすアミリン誘導性の内皮機能不全。 HIP ラットでは、Aβ の分解速度の変化、Aβ の免疫学的隠蔽を引き起こす凝集の増加、Aβ の流入の亢進、または Aβ の血中濃度の増加など、輸送の減少以外の原因が Aβ の血漿対脳比の減少を説明できる可能性があります。。

TaqMan 遺伝子発現アッセイを使用した以前の研究では、炎症誘発性および抗炎症性ミクログリア遺伝子の両方が、HIP 群と WT ラット群で差次的に発現 (DE) していることが判明しました 25。血液中の膵臓アミロイド形成ヒトアミリンへの慢性曝露に関連する脳遺伝子の考えられる十分な分子パターンを予測するために、我々は、HIP 対 WT 雄ラット（年齢 15 ～ 16 歳）の海馬遺伝子の RNA-seq および遺伝子発現ネットワーク解析を使用しました。 -月）。 HIP ラットと WT ラット (n = 10 雄/グループ) からの RNAseq データの比較により、差次的に発現された 408 個の遺伝子転写物の同定が可能になりました (P < 0.05)。上方制御されたDE遺伝子と下方制御されたDE遺伝子の変化の特徴的な大きさの範囲を図7aに示します。 DE 遺伝子には Ingenuity Pathway Analysis (IPA) データベースで注釈が付けられ、これらの遺伝子によって表される複数の標準経路の濃縮が特定されました (図 7b)。 WTラットと比較したHIPラットのDE遺伝子のうち、25個の遺伝子が、これらのDE遺伝子の階層的クラスタリングヒートマップによって示されるように、上位5つの標準経路の濃縮を同定した（図7c）。さらに、注釈、視覚化、統合発見データベース（DAVID）を使用して、遺伝子オントロジー（GO）に基づいて408個のDE遺伝子を、WTラットと比較してHIPが豊富な生物学的プロセスに分類しました（図7d）。これらの結果（図7b〜d）は、炎症、代謝の変化、低酸素に対する細胞反応に関与する遺伝子の調節不全が、血中アミリン濃度の慢性的な上昇、脳血管アミリン沈着、脳内Aβクリアランス障害と関連している可能性を示唆しています。

a HIP 対 WT ラット脳における DE 遺伝子の Log10 (p 値) 対 Log10 (変化倍数)。各ドットは 1 つの遺伝子を表し、赤色で上方制御 (HIP 対 WT、≧ 1.5 倍の変化)、青色で下方制御 (HIP 対 WT、≧ 1.5 倍の変化)、黒色で < 1.5 倍の変化を示します。。 b HIP対WTラットグループの海馬組織のRNA-seq分析によって検出された差次的発現（DE）遺伝子のIngenuity Pathways Analysisによって特定された上位5つの標準経路（ P < 0.05）（ n = 10雄/グループ）。 c 25 DE 遺伝子の階層的クラスタリングにより、(b) の上位 5 つの標準経路の濃縮が特定されました。 d WTラットグループと比較してHIPラットグループで富化された上位5遺伝子オントロジー（GO）生物学的プロセス。

ヒトおよび実験動物モデルから得た我々のデータは、脳Aβ病態の発症を可能にする潜在的に重要なメカニズムには、膵臓から分泌されるアミロイド形成アミリンの脳血管蓄積が関与していることを示している。膵臓アミリンは 2 型 DM の発症に寄与するため、我々の結果は、2 型 DM と AD の間の分子の欠落の可能性としてアミリン -Aβ 相互作用があり、治療への有望な新しいアプローチであることを示唆しています。私たちは、アミリン誘発性の脳 Aβ クリアランス障害の根底にあると思われる 3 つの相互依存要因を発見しました。 1、血中アミリン濃度は、認知症のない人に比べて認知症の人で増加します。 2、血中のアミロイド形成アミリン濃度が慢性的に増加すると、全身性炎症を反映して循環単球におけるアミリン蓄積が促進され、脳血管アミリン沈着が引き起こされます。 3、脳血管アミリン沈着は、血管壁および血管周囲腔におけるアミリン-Aβの共局在によって示されるように、BBBを通過するLRP1-Pgp媒介Aβ輸送および血管壁に沿った間質液排出によるAβクリアランスを混乱させる。

代償性インスリン分泌はインスリン抵抗性の中心であり、アミリン分泌の増加と同時に起こります8、9、10（認知障害のない人から軽度の認知障害および認知症までの認知連続体にまたがるコホートの参加者における現在のデータによっても証明されています。図1d）。 2 型 DM 患者は、臨床診断されるまで何年もインスリン抵抗性であることを考慮すると、膵臓アミリンアミロイド沈着 8,9,10、NLRP3 インフラマソーム活性化、および炎症誘発性 IL の分泌増加に関連する慢性高アミリン血症にさらされています。マクロファージおよび樹状細胞からの 1β11、12、13。血漿IL-1β濃度の上昇に関連してアミリンが循環単球に取り込まれることを示す我々のデータは、血中の膵アミロイド形成アミリン濃度の上昇に対する自然免疫応答の可能性を示している。これらのデータは、血管周囲炎症を引き起こす脳血管アミリン沈着が、少なくとも部分的には、前糖尿病に関連した血液中の膵アミロイド形成濃度の上昇に対する不適切な自然免疫反応によって発生する可能性があることを示唆している。今後の研究では、アミリン-IL-1β経路の調節がアルツハイマー病の状況における神経炎症に対抗するアプローチを提供する可能性があるかどうかを決定する必要がある。

血管周囲の Aβ 沈着は AD 脳によく見られ、間質液排出障害が原因であると考えられています 2、3、4。間質液排出の原動力は、血管平滑筋細胞の自発的な収縮と弛緩によって生じます2、3、4。我々の結果は、アミリン媒介全身性炎症と、血管壁内のアルギナーゼ-NO調節不全を介した脳血管拡張およびCBFの減少との間の関連性を示している。私たちのデータはまた、膵臓のアミロイド形成アミリンが脳毛細血管に蓄積し、BBB を通過する Aβ 輸送を媒介するタンパク質である P-gp および LRP1 の発現に影響を与える可能性があることを示しています。 APOE/LRP1 調節経路は脳 Aβ クリアランスにおいて十分に確立された役割を持っていますが 46、血管の内腔側からのアミリンによって LRP1 発現が下方制御され得る可能性は、アルツハイマー病の病態を軽減するための新規の治療標的となる可能性があります。

結論として、我々のデータは、血液中のアミリン蓄積および循環単球を測定することによる膵臓アミリン調節不全のスクリーニングにより、脳微小血管およびアルツハイマー病のリスクが高い人々を特定できる可能性があることを示唆しています。また、認知症のない 2 型糖尿病患者では、実行機能と作業記憶の障害が一般的であり、アミリン調節不全は 2 型糖尿病と関連しており、これらの臨床影響の一因となっている可能性があるため、これは重要です。 2 型 DM と AD は、増大する世界的な健康上の脅威である 2 つであり、グルコースとインスリンの調節異常を超えた分子因子としてアミロイド形成アミリンが関与している可能性がある複雑なメカニズムを通じて関連しているようです 14,47,48,49,50。アミリン媒介性脳血管炎症、脳内 Aβ クリアランス障害、脳内遺伝子発現調節異常は、膵臓のアミリン過剰分泌 (糖尿病前症) の生物学的特徴として現れます。今回のデータは、血中アミリン濃度が慢性的に上昇している前糖尿病性インスリン抵抗性の状況において、脳血管炎症のメカニズムと脳からの Aβ 除去障害のリスクについての理解を深める可能性がある。膵臓のアミロイド形成アミリンによって引き起こされる全身性および脳血管の炎症を阻害すると、脳血管のアルギナーゼ-NO調節不全、血管収縮、血流の減少、脳内Aβ蓄積が軽減される可能性があります。

この研究では、ケンタッキー大学治験審査委員会によって承認されたプロトコールに基づいて、ケンタッキー大学アルツハイマー病研究センター（UK-ADRC）のバイオバンクから匿名化された全血、血漿、および凍結およびホルマリン固定された脳組織が使用されました（治験審査委員会）。インフォームドコンセントは前向きに得られました。非認知障害から軽度認知障害および認知症までの認知連続体にわたるコホートの参加者 83 人から全血サンプルが収集され、80 個のサンプルが分析されました (すべて同じアミリン ELISA キットに含まれています)。測定は二重に実施した。凍結側頭皮質組織サンプルは、アミロイド β (Aβ) 陽性が証明された sAD 型認知症患者 42 名と認知障害のない 18 名から採取されました。血漿と凍結脳組織の両方を 20 人から入手しました。ホルマリン固定された背外側前頭皮質 (ブロードマン野 9) を 32 名から入手しました。サンプルサイズ、認知状態、性別、糖尿病の状態、年齢など、各タイプの組織を提供する個人の概要統計を、臨床情報および神経病理学的情報とともに表 1、2 に示します。糖尿病の有無は、患者または介護者の自己申告および糖尿病薬の使用によって生涯（長期にわたる臨床来院時）に判定された。臨床的認知症および神経病理学的特徴（神経炎性アミロイド斑、アルツハイマー病レジストリ確立コンソーシアム（CERAD）、ブラークNFTステージ、脳アミロイド血管症（CAA）重症度など）の評価は、公開されたプロトコルに従ってスコア化されました27、28、29。、30、31。脳血管アミリン Aβ 沈着の二次 IHC 分析を fAD 脳のサブセット (n = 27) で実施し、IHC および ELISA21 を通じてアミリン蓄積が記録された。 fAD 変異保有者のホルマリン固定側頭皮質組織は、UCL クイーンスクエア神経学研究所 (英国) およびキングスカレッジロンドン (英国) の神経疾患のためのクイーンスクエアブレインバンクから提供されました。

すべてのヒト組織サンプルに対して観察者ブラインド分析が実行されました。結果は、アルツハイマー病の病理/認知機能との関係を評価するために、ケンタッキー大学のアルツハイマー病センターに伝えられました。研究者らは、組織学的分析のスコアリングや、偏見を防ぐための長期的な動物行動試験においても盲検化された。介入は同じ職員によって行われたため、研究者は薬理学的介入/注射中に盲検化されませんでした。ほとんどの生化学的アッセイでは、必要がないため、研究者は盲検化されませんでした。データ収集は、同じ設定の実験グループに対して同時に実行されました。

この研究は、米国国立アカデミー出版局発行の実験動物の管理と使用に関するガイド (2011 年第 8 版) に準拠しており、ケンタッキー大学の施設内動物管理使用委員会によって承認されました。ラットは個別に換気されたケージ内で 12 時間の光サイクルで飼育され、標準的なペレット食と水を自由に摂取しました。

膵臓におけるアミロイド形成ヒトアミリンの発現に関連して2型糖尿病を発症するラット（HIPラット、雄、n = 84）と、膵臓において内因性の非アミロイド形成性ラットアミリンを発現する対照野生型ラット（WTラット）を比較しました。 ; n = 52)。繁殖ペアは Charles River Laboratory から購入しました。血中アミリンおよびグルコースの断面分析には、生後 6 ～ 8 か月、生後 10 ～ 12 か月、および生後 15 ～ 16 か月の HIP ラットを使用しました。他のすべての実験では、生後 15 ～ 16 か月のラットを使用しました。さらに、APP/PS1/HIP ラット（n = 10 雄、生後 15 ～ 16 か月）を使用して、AD 様の病状における脳血管 Aβ に対する膵臓アミロイド形成ヒトアミリンの影響を研究しました。 APP/PS1/HIP ラットは、以前に記載されているように生成されました 21。簡単に言えば、大学ラット資源研究センターからの TgF344-19 ラット。ミズーリ州コロンビア州ミズーリ州のラット (APP/PS1 ラット) は、スウェーデン変異 (K595N/M596L) を持つヒト Aβ (A4) 前駆体タンパク質 (hAPP) 遺伝子と、エクソンの欠失を持つプレセニリン 1 (PSEN1) 遺伝子を発現するフィッシャーラットです。 9、マウスプリオンプロモーター (Prp) によって駆動されます。 APP/PS1 ラットを HIP ラットと交配して、ヒトアミリン、APP、および PSEN1 について三重トランスジェニックであるラット (APP/PS1/HIP ラット) を生成しました。非アミロイド生成性ラットアミリンを発現するAPP/PS1ラット（n = 10匹の雄、15〜16ヶ月齢）は、アミロイド生成性ヒトアミリン効果の対照として機能した。また、アミリンノックアウト（AKO）21 ラット（n = 3 雄、15 ～ 16 か月齢）の膵臓組織および脳組織をアミリン発現の陰性対照として使用しました。合計 n = 159 匹の雄ラットが研究に使用されました。

MRI スキャンは、水平型 7 T 核 MRI スキャナー (ClinScan、Brucker BioSpin MRI、エットリンゲン、ドイツ) を使用して、HIP および WT 同腹子に対して実施されました 18。冠状 T2 強調画像は、一般パラメータを使用して取得されました: 視野 (FOV) 40 mm、繰り返し時間 (TR) 3000 ms、エコー時間 (TE) 24 ms、スライス厚 1 mm、スライス間ギャップ 1 mm、7 スライス。脳灌流は、公開されている ASL プロトコル 35 を使用して評価されました。解剖学的画像と灌流画像は、ASL ツールボックスルーチンで同時登録およびフィルタリングされました。両方の組織を除外するには閾値設定が不十分な場合があるため、脳の外側から両方の組織を除外するマスクを各ラットに対して手動で定義しました。また、脳の端にあるピクセルは、おそらく部分体積と感受性の影響により、灌流値に大きな変動をもたらしているため、除外されたことも判明しました。灌流値は、偏りを避けるために、ラットがどのグループに属しているかを知ることなく決定されました。

ラットの前肢欠損は、シリンダーテストにおける前肢と壁の接触時間によって評価されました。ラットのバランス能力は、動物が上昇する傾斜面で滑り始めた角度を記録することによって測定されました。ラットの後肢の異常は、後肢握り締めの重症度をスコア化することによって評価した。ロータロッド試験では、試験の 2 日前に動物を静的ロッドに慣れさせました。テスト当日、ロータロッドの速度は 2 分以内に 0 rpm から 40 rpm まで増加しました。各ラットは、連続 5 日間にわたって 1 日あたり合計 4 回、ロータロッドでテストされました。各訓練日について、各ラットの転倒潜時の最小値は破棄された。残りの読み取り値を平均し、HIP グループと WT グループのグループ平均を計算しました。解析には複合 Z スコア法が使用されました21。各行動試験について、平均および標準偏差は、実験グループ全体の動物からの長期評価から収集された個々の変数から計算されました。各行動テストにおける各動物の Z スコアは、次の式を使用して計算されました。

各動物の複合スコアは、各テストの Z スコアを平均することによって計算されました。

免疫組織化学では、公開されているプロトコールを使用して、ヒトおよびラットのホルマリン固定パラフィン包埋脳組織を処理しました 15、18、21、25、26、34。簡単に説明すると、組織切片をキシレン中で 5 分間 3 回脱パラフィンしました。切片をアルコールの段階希釈(100%、95、および70%)で2回再水和し、PBSで1回洗浄した。内部の内因性ペルオキシダーゼをブロックするために、切片を 3% H2O2 (メタノールで希釈) 中で 30 分間室温でインキュベートしました。次いで、抗原回復のために、切片を1×回復バッファー(S1699; Dako)中でスチーマー中95℃で30分間インキュベートした。切片を室温まで冷却し、1×PBSで1回洗浄した。切片を１５％ウマ血清溶液中で１時間ブロックし、ＰＢＳで１回洗浄した。切片をアミリン抗体とともに24時間インキュベートした。 2日目に、すべての切片を1×TBSで2回洗浄した。すべての切片をビオチン化 IgG 二次抗体とともに 1 時間インキュベートしました。すべての切片を再度洗浄し、ABC複合体とともに30分間インキュベートしました。すべての切片を洗浄し、AEC 色原体で発色させました。切片を洗浄し、10% NGS中で1時間ブロックした。切片を二次一次抗体とともに一晩インキュベートした。 3日目に、すべての切片を洗浄し、AP結合二次抗体とともに1時間インキュベートしました。すべての切片を洗浄し、Stay-green 色原体で発色させました。すべての切片を洗浄し、ヘマトキシリンで対比染色し、水ベースの封入剤に封入しました。アミリン (1:200; T-4157、Bachem-Peninsula Laboratories)、GFAP (1:400; 3670S、Cell Signaling Technology)、CD68 (1:200; MCA341GA、Biorad)、CD11b (1:200; MCA275GA) に対する抗体、Ｂｉｏｒａｄ、）およびＡβ（１：４００；クローン６Ｅ１０、８０３００２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）が一次抗体であった。ビオチン化 IMPRESS 馬抗マウス AP 結合 IgG (1:100、A3562、Sigma) およびビオチン化抗ウサギ IgG (1:300、BA-1100、Vector) を二次抗体として使用しました。ヒトとラットの両方の脳組織におけるアミリン抗体の特異性は、以前の研究で確立されています 15、18、21、25、26、34。 AKOラットの膵臓組織をアミリンの陰性対照とした。

免疫蛍光実験では、公開されたプロトコルを使用して処理されたホルマリン固定パラフィン包埋ヒト脳組織を使用しました 18,21。簡単に説明すると、組織切片をキシレンで脱パラフィンし(3回、各10分)、アルコールの段階希釈(100%、95%、85%)で再水和し、1×PBSで1回洗浄しました。抗原賦活化はクエン酸緩衝液（1×、S1699; Dako）中で行った（90℃で30分間加熱）。切片をブロッキング緩衝液(1×TBS中5% NGS、2% BSAおよび0.25% Triton-X)中で室温で1時間ブロックした。ブロッキング後、切片を一次抗体混合物中で 4 °C で 24 時間インキュベートしました。切片を1×トリス-NaCl溶液で洗浄した(3回、各5分)。切片を二次抗体混合物中で室温で１時間インキュベートした。切片を前と同様にトリNaClで洗浄し、0.2%スーダンブラック中で5分間インキュベートして自己免疫蛍光をブロックした。切片を1×PBSで3回洗浄し、封入剤に封入した。 24 時間の装着後に切片を画像化しました。抗アミリン (1:200; クローン E5; SC-377530; Santa Cruz、および 1:200; および T-4157、Bachem-Peninsula Laboratories)、Aβ (1:400; クローン 6E10、803002、Biolegend)、IL- 1β (1:400; ab9722、abcam)、抗コラーゲン IV (1:500; ab6586; abcam)、抗α平滑筋アクチン-Alexa Fluor 405 (1:200; ab210128、abcam)、抗カベオリン-1 (1:100; sc-894; Santa Cruz, TX)、抗 LRP1 (1:500; sc-57351; Santa Cruz)、抗 4HNE (1:200; ab46545; abcam) が一次抗体でした。二次抗体は次のとおりでした: Alexa Fluor 488 抗ウサギ IgG (A11034; Thermo Fisher)、Alexa Fluor 488 結合抗マウス IgG (1:300; A11029; Invitrogen)、Alexa Fluor 568 結合抗ウサギ IgG (1:200; A11036) ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５６８結合抗マウスＩｇＧ（１：３００；Ａ１１００４；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。核をDAPI封入剤で対比染色した。ヒト脳組織の三重染色では、ヒトアミリンおよびコラーゲン IV の染色後に平滑筋アクチン-Alexa Fluor 405 抗体を添加し、DAPI フリーの封入剤を使用しました。チオフラビン S 染色の場合、二次抗体のインキュベーション後、脳スライドを 0.5% チオフラビン S 中で室温で 30 分間インキュベートしました。次いで、スライドを７０％エタノール中で３分間、０．２％スーダンブラック中で５分間インキュベートした後、洗浄および封入した。

IHC 分析では、ImageJ の Color Deconvolution プラグインを使用して、各抗体 (アミリン、Aβ) の免疫反応性強度シグナルをデコンボリューションし、分析しました。ベクトル決定 (RGB プロファイル) と閾値は、単一の染色 (つまり、試験した各抗体の陽性対照) の画像を使用して、対象の色ごとに確立されました。各画像のしきい値は、背景を視覚的に最小限に抑えるように設定されています。確立された RGB プロファイルとしきい値がマクロスクリプトコマンドに適用されました。マクロスクリプトコマンドを実験グループに適用し、対象の色について陽性の領域の割合を測定しました。脳血管のアミリン Aβ 沈着を推定するために、アミリン、Aβ、またはその両方が陽性である明確に定義された血管をカウントしました。血管数の数は、全画像領域に対して正規化されました。

新たに単離した脳毛細血管を、一次抗体（抗ヒトアミリン; T-4157; ペニンシュララボラトリーズおよび抗グリコホリン A; sc-71159 Santa Cruz biotech）および二次抗体（ウサギ IgG-atto 647 およびマウス IgG- atto 488) を以下のように参照: ガラス底の 35 mm ディッシュ (P35G-0.170-14-C、MatTek Corporation) を超音波処理器上で 1 M KOH で 15 分間洗浄し、Milli-Q 水ですすぎ、UV 光下で少なくとも 30 分間滅菌しました。。新たに単離した脳毛細血管を上記の皿上に周囲温度で30分間プレーティングし、500μlの1×PBSで洗浄した。毛細管を200μlの3%PFA + 0.1%グルタルアルデヒドで周囲温度で10分間固定し、200μlの0.1% NaBH4で周囲温度で7分間還元した。キャピラリーをPBSで3回洗浄し、ロッカー上で周囲温度で120分間、200μlのブロッキング緩衝液(PBS中3% BSA + 0.2% Triton X-100)でブロックした。次に、一次抗体カクテル 200 μl をロッカー上で周囲温度で 60 分間添加し、200 μl の洗浄緩衝液 (0.2% BSA + 0.05% Triton X-100 in PBS) で 1 回の洗浄当たり 15 分間、周囲温度で 5 回洗浄しました。ロッカーの上で。洗浄後、150μlの二次抗体カクテルを周囲温度で30分間添加し、ロッカー上で各洗浄ごとに10分間、200μlの洗浄緩衝液で3回洗浄した。キャピラリーを200μlの3%PFA + 0.1%グルタルアルデヒドで周囲温度で10分間後固定し、500μlのPBSに保存し、STORMイメージングバッファー[7μlのGLOX（酸素スカベンジャー）および70μlのMEA（塩酸システアミン）中に保管しました。 Nikon N-SIM N-STORM (Nikon) 顕微鏡を使用したイメージング中に、+ 620 μl のバッファー B (Tris-HCL/NaCl)]。

脳からのホルマリン固定およびパラフィン包埋切片 (10 μm) を再水和し、95% ギ酸で周囲温度で 3 分間前処理して、抗原を露出させました。 150 mmol/L NaClを含む50 mmol/L Tris-HCl緩衝液（pH 7.4）ですすいだ後、脳切片を一次抗体抗ヒトアミリン（抗ヒトアミリン; T-4157; ペニンシュララボラトリーズ）およびマウス抗アミリンとともにインキュベートしました。 -Aβ 抗体 6E10 (803002、Biolegend) を 4 °C で一晩。 Duolink in situ PLA (Duolink In situ PLA、DUO92004、Sigma、米国) は、公開されているプロトコル 26 に従って実行されました。簡単に説明すると、一次抗体ペアの検出のために、切片を、トリス緩衝生理食塩水で 1:6 に希釈したオリゴヌクレオチド結合抗マウス IgG MINUS および抗ウサギ IgG PLUS (PLA プローブ) とともに 37 °C で 90 分間インキュベートしました。増幅された DNA 鎖は蛍光団に結合したオリゴヌクレオチドで検出され、核はヘキスト色素で染色されました。

各血液サンプル (100 μl) を、CD14 (Abcam、ab203294、1:400) およびヒトアミリン (Santa Cruz、SC-377530、1:100) の一次抗体の混合物とともに周囲温度で 30 分間インキュベートしました。血液を２ｍｌの溶解緩衝液（１×ＢＤ溶解溶液、カタログ番号３４９２０２、ＢＤＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中で５分間溶解し、４％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含む１×ＰＢＳ中で洗浄した。洗浄後に残った細胞を二次抗体中で周囲温度で30分間インキュベートし、その後洗浄し、4% FCSを含む1×PBS 0.5 mlに再懸濁した。二次抗体は、ヒトアミリンに対する Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H + L) (カタログ番号 A11029; Invitrogen、4% FBS を含む 1×PBS で 1:200 希釈)、および Alexa Fluor 568 ヤギ抗マウス (カタログ番号 A11004) でした。、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、４％ＦＢＳを含む１×ＰＢＳで１：２００希釈）、それぞれＣＤ１４について。フロー分析は、Cytometers BD Symphony A3 で実行されました。残りの細胞を SSC-A 対 FSC-A でゲートし、生細胞集団を決定しました。ダブレット (凝集した細胞) は、FSC-H 対 FSC-A を使用してゲートアウトされました。非凝集細胞をさらにゲート制御して、CD14 および/またはヒトアミリンに対して陽性の単球を選択しました。ネガティブコントロール（抗体なし）とポジティブコントロール（ヒト単球）を使用して上限と下限を設定しました（補足図S4）。

データは BDFacsDiva を使用して取得され、FlowJo v10 ソフトウェアを使用して分析されました。

凍結ヒト脳組織をホモジネートバッファー（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、50 mM NaF、2% Triton X-100、0.1% SDS、1% (v/v) プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、pH 7.5）中でホモジナイズしました。。ホモジネートを 17,000 × g、4 °C で 30 分間遠心分離しました。遠心分離後に上清をペレットから分離し、すべての実験に使用しました。凍結ラット脳サンプルを、20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1% Triton X-100 (v/v)、1% を含む 1% Triton 緩衝液 (組織容積の 25 倍) でホモジナイズしました。 (v/v) プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤、pH 7.5。ホモジネートを氷上に15分間放置した。ホモジネートを 22,000 × g、4 °C で 15 分間遠心分離しました。上清（トリトン可溶性画分）をペレットから分離し、すべての実験に使用しました。

アミリン ELISA (EZHA-52K、Millipore Sigma) を使用して、全血溶解物、血漿、毛細管溶解物および脳ホモジネート中のアミリン濃度を測定しました。インスリン濃度は、サンドイッチ ELISA キット (AYQ-E10465、アッセイソリューション) を使用して全血溶解物中で測定されました。脳ホモジェネート中の Aβ42 濃度は、Aβ42 用サンドイッチ ELISA キット (Thermo Fisher Scientific、カタログ番号 KHB3441) を使用して測定しました。 IL-1β (ab255730、abcam)、アルギナーゼ 1 (MBS289817、MyBioSource)、およびアルギナーゼ 2 (MBS7216305、MyBioSource) の ELISA を製造業者のプロトコールに従って使用しました。標的タンパク質の濃度は、BCA 法を使用して評価された総タンパク質投入量に対して正規化されました。

アルギナーゼ活性は、比色アッセイ（MAK112、Sigma、MO、USA）を使用して脳微小血管溶解物中で測定されました。アッセイは、公開されているプロトコールに従って実施されました34。簡単に言うと、サンプルを10μlの5×基質バッファーとともに37℃で2時間インキュベートしました。サンプルブランクウェルには基質を添加しませんでした。アルギナーゼ反応を停止させるために、200μlの尿素試薬を各ウェルに添加しました(尿素標準、水、サンプルおよびサンプルブランク)。次に、10μlの5×基質緩衝液をサンプルブランクウェルに添加し、37℃で60分間インキュベートした。吸光度を430 nmで読み取った。アルギナーゼ活性は、製造業者の分析指示に基づいて計算されました。

ラット血漿サンプルの亜硝酸塩アッセイ (M36051、Molecular Probes) および硝酸塩アッセイ (ab65328、Abcam) を製造業者のプロトコールに従って実行しました。簡単に説明すると、亜硝酸塩アッセイでは、最初の 100 μl の亜硝酸塩定量試薬をマイクロプレートにロードし、次に 10 μl の亜硝酸塩標準サンプルと血漿サンプルを 2 回ずつ追加しました。マイクロプレートを周囲温度で 10 分間インキュベートし、その後 5 μl の亜硝酸塩定量展開液を各ウェルに添加しました。最適な発色の後、蛍光強度を365/450 nm (励起/発光) で測定しました。硝酸塩アッセイでは、最初の 85 μl の硝酸塩標準と 85 μl の血漿サンプルを 2 連でマイクロプレートにロードし、次に 5 μl の硝酸レダクターゼと 5 μl の酵素補因子を各標準ウェルとサンプルウェルに添加しました。プレートを周囲温度で１時間インキュベートした。次に、5 μl のエンハンサーを各標準およびサンプルに加え、続いて 50 μl の Griess 試薬 R1 および R2 を加えました。出力強度はマイクロプレートリーダーで540 nmで測定されました。

脳毛細血管は、公開されているプロトコールを使用してラットの脳から単離されました18。脳を氷冷したPBS中でホモジナイズし、チューブを静かに反転させることによって30%フィコール溶液と混合し、次いで5800×gで20分間、4℃で遠心分離した。ペレットを１％ＢＳＡを含む氷冷ＰＢＳに再懸濁し、ガラスビーズカラムに通した。 25 mL ピペットを使用してビーズを 1% PBS を含む PBS 中で撹拌し、溶液を 2 本の 50 mL チューブに均等に分割しました。チューブを遠心分離し、ペレットを 0.5 ～ 1 mL の PBS に溶解して実験に使用しました。

中大脳動脈を除去し、結合組織を除去し、(mmol/L) 130 NaCl、1 KCl、0.2 CaCl2、0.5 MgCl2、0.33 NaH2PO4、3 ピルビン酸、25 HEPES、および 22 グルコース (pH に調整) を含む消化緩衝液に入れました。 7.4 NaOH を使用)。次に、動脈をパパイン (0.5 mg/mL) およびジチオスレイトール (1 mg/mL) を添加した消化緩衝液中で 37 °C で 15 分間インキュベートし、続いて Sigma を添加した消化緩衝液中で 2 回目のインキュベーション (37 °C で 15 分間) を行いました。コラゲナーゼタイプ F およびタイプ H (それぞれ 1 mg/mL)。次いで、動脈を消化緩衝液で洗浄し、氷上で15分間保持し、その後、火で磨いたパスツールピペットで穏やかに撹拌して細胞懸濁液を作成した。

動脈緊張は、IonOptix Vessel Diameter システムと公開されたプロトコルを使用して、新たに分離された軟膜動脈と後大脳動脈で測定されました 36。簡単に言うと、新鮮なラットの脳から動脈を分離し、結合組織を除いて解剖しました。 HEPES-PSS (141.9 mM NaCl、4.7 mM KCL、1.7 mM MgSO4、0.5 mM EDTA、2.8 mM CaCl2、10 mM HEPES、1.2 mM KH2PO4 および 5 mM グルコース)中で枝を結んだ。動脈の一方の端を筋電計の実験室内でマイクロピペット上にカニューレを挿入し、もう一方の端をブラインドで閉じた。安定した圧力を維持することで漏れがないことを確認しました。最初に管腔内圧を 10 mmHg に 15 分間維持し、次に管腔内圧を 20 から 60 mmHg に増加させ (20 mmHg→40 mmHg→60 mmHg→80 mmHg-→100 mmHg-→120 mmHg)、動脈緊張の発達を刺激しました。血管内圧の各増加後の安定した直径を活動直径として記録した。次に、HEPES-PSS を 0 カルシウムおよび 2 mM EGTA に置き換えて、動脈の受動的直径を測定しました。管腔内圧力は反対方向に減少し、各圧力点の最大受動的直径が記録されました。動脈緊張度は、次の式を使用して計算されました: 動脈緊張度 = ((受動直径 - 活動直径) / 受動直径) * 100)。

脳ホモジネートおよび血漿から Aβ を免疫沈降するには、公開されているプロトコールを使用しました 21。簡単に説明すると、1 mg のタンパク質を抗ラット Aβ (2 μg; CST2454; Cell Signaling Technology) とともに、上下回転させながら 4 °C で一晩インキュベートしました。抗原抗体複合体を固定化プロテイン A/G 樹脂スラリーに周囲温度で 2 時間添加し、洗浄し、溶出緩衝液を使用してサンプルを樹脂から溶離しました。溶出液はウェスタンブロット分析に使用されました。軽鎖および重鎖 IgG の両方に対する Amersham ECL ウサギ IgG、HRP 結合全抗体 (ロバ由来) (Cytive、カタログ番号 NA934V-HRP) が二次抗体でした (1:20,000 希釈)。

公開されているプロトコールを使用して、ラットから単離した脳毛細血管、脳組織ホモジネートおよび血漿に対してウェスタンブロット分析を実施しました15、18、21、25、26、34。 2% SDS を含む RIPA バッファーを使用して、凍結脳サンプルから Aβ モノマーを回収しました。ライセートを 17,000 × g で 30 分間遠心分離しました。遠心分離後、上清をペレットから分離し、ウエスタンブロッティングに使用しました。総タンパク質レベルは、BCA キット (23225、ThermoFisher) を使用して推定されました。 LRP1 の β サブユニットを認識する抗 LRP1 抗体 (1:1,000; クローン 5A6; sc-57351; Santa Cruz)、抗 P 糖タンパク質または Pgp (1:1000、ab170904、Abcam)、ウサギ抗アミリンポリクローナル ( 1:2000; T-4157、Bachem-Peninsula Laboratories、カリフォルニア州)、抗ラットおよびヒト Aβ (1:1,000; 2454; Cell Signaling Technology)、マウス抗 β アクチン (1:10,000; クローン BA3R; MA5-15739) ; Thermo-Fisher）、マウスモノクローナル抗 GAPDH（1:10,000; クローン 6C5; ab8245; Abcam）、抗ウサギ IgG HRP コンジュゲート（1:30,000; NA934VS; GE Healthcare）および抗マウス IgG HRP コンジュゲート（1: 20,000、NXA931、GE Healthcare）が一次抗体でした。脳ホモジェネートから免疫沈降したラット Aβ および対応する血漿 (組織ホモジェネートまたは免疫沈降したラット Aβ 溶出液からのタンパク質 50 μg) を 8% SDS-PAGE ゲルにロードしました。脳ホモジェネートから凝集した Aβ をネイティブ PAGE (非還元、非変性) で分離しました。単量体 Aβ ペプチドは、8 M 尿素を含む酸性 Bis-Tris ゲルで分離されました。単量体 Aβ のシグナルを増強するために、ブロッキングステップの前に膜を PBS 中で 3 分間煮沸しました。細胞および脳の毛細管溶解物中の LRP1 は、非還元条件下で 4 ～ 12% Bis-Tris ゲルを使用して分離されました。 HRP結合抗ウサギまたは抗マウスは二次抗体でした。ウエスタンブロット実験におけるローディングが等しいことは、モノクローナル抗βアクチン抗体（マウスで飼育、クローンBA3R、Thermo Scientific; 1:2000）を使用して再プローブすることによって検証されました。タンパク質レベルは、ImageJ ソフトウェアを使用した濃度分析によって比較されました。免疫沈降後のウェスタンブロッティングで同定されたバンドの特異性をテストするために、ネガティブコントロール実験を実施しました（図5b）。簡単に説明すると、二重の脳ホモジネートおよび血漿サンプル (総タンパク質 1 mg) を以下の免疫沈降に使用しました。 1、抗 Aβ 抗体 (CST2454; Cell Signaling Technology); 2、抗 IgG 抗体 (Cytive、カタログ番号 NA934V-HRP)。ブロットとブロッキングの後、両方のメンブレンを抗 Aβ 抗体とともにインキュベートし、さらに分析して一緒に画像化しました。結果は、IgG 免疫沈降サンプルセットで免疫反応性シグナル強度がないか、またはわずかであることを示し (補足図 S5)、Aβ 抗体の特異性を示しています。

凍結乾燥したアミド化ヒトアミリンペプチド（Anaspec #AS-60254-1）を、50μMの濃度までPBS pH 7.4に溶解した。混合物を時々振盪しながら37℃で72時間インキュベートして、アミリンが凝集体を形成できるようにした。凝集したヒトアミリン溶液を、9 ～ 10 か月齢の AKO ラットに尾静脈から (60 μg/kg) (n = 3 匹の雄ラット)、尾静脈から 1 週間毎日注射しました。

我々は、EC 単層へのアミリンの沈着と、その結果として EC 単層を横切る Aβ 輸送に及ぼす影響を備えた in vitro BBB モデルを使用しました。簡単に説明すると、初代ラット脳微小血管内皮細胞 (Cell Applications Inc) を、孔径 0.4 μm のポリカーボネート膜 (Costar、Corning、NY、USA) を備えた 24 ウェル Transwell-Clear インサート上にプレーティングし、初代ラット脳星状細胞 (Sigma) を培養しました。底の井戸。バリアの完全性は、STX-3 電極を備えた EVOM2 メーター (World Precision Instruments) を使用して、経内皮電気抵抗 (TEER) から測定しました。最大 TEER は培養 8 ～ 10 日以内に達成されました。ヒトアミリン (10 μM; Anaspec; AS-60254-1)、ラットアミリン (10 μM; American Peptide) および DMSO (1 mM; ビヒクル) に対する BBB 透過性を、ハンクス液で希釈した FITC-Dextran 4 kDa (Fisher Scientific) を使用して評価しました。傍細胞拡散マーカーとして 0.1% BSA を含む平衡塩類溶液 (HBSS) バッファー (HBSS-BSA)。透過係数は次の式を使用して計算されました。 P = (ΔQ/Δt)/(A*C0)、(ΔQ/Δt) = FITC-デキストラン変化率。 A = インサートの表面積 (0.33 cm2); C0 = 初期の FITC-デキストラン入力。

Aβ42 トランスサイトーシス実験では、EC 単層をヒトアミリン (10 μM) またはビヒクル (DMSO) とともに 24 時間インキュベートしました。洗浄後、内腔チャンバーを HBSS-BSA に、反管腔チャンバーを Aβ(1-42)-FAM (5 μM; Bachem) または FITC-Dextran にそれぞれ交換しました。 Aβ(1-42) サンプルは、以前に記載されているように、Aβ(1-42) - FAM および FITC-デキストラン蛍光強度および Aβ(1-42) トランスサイトーシス商 (TQ) の測定のために管腔チャンバーから収集されました [38] : TQ = (Aβ(1–42) − FAM 管腔 /Aβ(1–42) − FAM 入力)/(FITC-デキストラン管腔 − FITC-デキストラン入力)。

CellTiter 96® AQueous One Solution 細胞増殖アッセイ (MTS) (Promega) を使用して、EC 単層上のアミロイド形成ヒトアミリンの細胞毒性を評価しました。

全RNAは、RNAqueous全RNA単離キットを製造業者のプロトコールに従って使用して単離した(Invitrogen、AM1914)。 cDNA の合成と増幅は、iTaq Universal SYBR Green One-Step Kit (Biorad; 1725151) と次のプライマー配列を使用して行いました。LRP1: フォワード (Fwd) 5ˊ-TTGTGCTGAGCCAAGACATC-3ˊ、リバース (Rev) 5ˊ-GGCGTGGAAGACATGTAGGT-3ˊ; および GAPDH: Fwd 5ˊ-GCTGCGTTTTACACCCTTTC-3ˊ、Rev 5ˊ-GTTTGCTCCAACCAACTGC-3ˊ (IDT, Inc.、米国)。 miRNAの定量では、ポリ(A)ポリメラーゼを備えたmiRNA cDNA合成キット(ABMgood、G902)を使用して、全RNAからcDNAを合成しました。 cDNAは、（rno-miR-103-3p、MPR00332; rno-miR-107-3p、MPR00335; RNU6 house Keepinggene、MP-r99998）（ABMgood）からのmiRNA特異的プライマーとともにSYBR Green mastermix（Biorad）を使用して増幅しました。データは 2-ΔΔCt 法を使用して分析され、実験は GAPDH または U6 miRNA に対して正規化されました。

内皮 LRP1 発現のアミリン誘導性抑制における miRNA シグナル伝達の役割を研究するために、miR-103-3p (MCR01039)、miR-107-3p (MCR01045) およびコントロール (MCH00000) 模倣物によるラット脳微小血管 EC のトランスフェクションを使用しました ( ABM良い）。 Antagomir miR-103-3p (IH-320345-05-0005)、miR-107-3p (IH-320348-05-0005) およびネガティブコントロール (IN-001005-01-05) (Dharmacon Inc.) を使用しました。 LRP1発現を救出する試み。すべてのトランスフェクションは、メーカーの推奨プロトコールに従って RNAiMAX (Invitrogen) を使用して行われました。簡単に説明すると、EC を 6 ウェルプレートに 50% コンフルエントでプレーティングし、続いて 100 nM の 103-3p および 107-3p 模倣体またはアンタゴミルのいずれか、およびそれぞれのネガティブコントロールを同時トランスフェクションしました。 12時間後、antagomir処理した細胞群を10μMヒトアミリンでさらに24時間処理した。トランスフェクションの 36 時間後、ウェスタンブロット分析のために細胞を収集しました。

凍結乾燥したヒトアミリン (上) を 20 mM Tris-HCl (pH 7.4) で 100 μM に再構成しました。トリス-HCl を使用してさまざまな濃度を作成しました。各時点で、50 μL の 0.016 mg/mL (50.17 mM) チオフラビン T (Sigma) を含む 96 ウェルプレートにそれぞれ 50 μL を加えました。赤血球 (RBC) を PBS で 1:10 に希釈しました。各ウェルに、50 μL の希釈 RBC/毛細管を加えました。次に、50 μL の 0.016 mg/mL ThioT 溶液 (PBS で作製) を各ウェルに添加しました。 437 nm励起および485 nm発光での蛍光を測定しました。シグナル強度検出用に最適化された ThioT の最終濃度は 50 μM でした。結果は総タンパク質投入量 (RFU/μg - 相対蛍光単位/μg) に対して正規化されました。実験は定量的試験ではない(ペプチド標準がない)ため、データはWT(またはAPP/PS1)ラットと比較した変化倍数として示されている。

脂質過酸化は、公表されているプロトコル 51 を使用して、単離された平滑筋細胞および培養ラット脳微小血管 EC で測定されました。簡単に説明すると、細胞を蛍光プローブ 4,4-ジフルオロ-5-(4-フェニル-1,3-ブタジエニル)-4-ボラ-3a,4a-ジアザ-s-インダセン-3-ウンデカン酸 (C11) とともにインキュベートしました。 -BODIPY581/591; D3861; Invitrogen; OR) および Liperfluo を室温で 20 分間処理。染色後、細胞を4回洗浄し、蛍光顕微鏡で分析しました。

HIP ラットと WT ラット (n = 10 雄/グループ) の間の遺伝子レベルの差次的発現を分析して、脳血管アミリン沈着の発生後のアミリン媒介性脳血管炎症に脳遺伝子が直接応答するかどうかをテストしました。大脳皮質 RNA は、Qiagen の RNeasy Mini Kit (Ref # 74104) を使用して単離されました。 Omega Bioservices は、Illumina HiSeq 2500 を使用して RNAseq ライブラリーの調製と配列決定を実行しました。RNAseq データは、PartekFlow ソフトウェア (Partek、ミズーリ州) を使用して分析されました。簡単に説明すると、RNAseq fastq ファイルをインポートし、ラット参照ゲノム (ドブネズミ-rn7) とアライメントし、Ensembl105 アノテーションを使用して遺伝子レベルで定量しました。 RNAseq リード数を正規化し、DESeq2 アルゴリズムを使用して HIP グループと WT グループ間の遺伝子発現差をさらに分析しました。 403 個の遺伝子の RNA 転写物存在量は、HIP グループと WT グループの間で P 値 ≤ 0.05 でした。これらの差次的発現 (DE) 遺伝子について、Ingenuity Pathway Analyses ソフトウェア (IPA、Qiagen) を使用して標準経路の濃縮についてクエリを実行し、さらに DAVID (NIH) を使用してこれらの DE 遺伝子のジーンオントロジー (GO) 生物学的プロセスの濃縮についてクエリを実行しました。

各分析におけるサンプルまたは動物の数、実行された統計分析、および P 値は、図および図の凡例で報告されます。動物行動研究のサンプルサイズはパイロット研究に基づいて決定されました。サンプルサイズは、既知の標準偏差、95% の信頼区間、およびアルファが 0.05 である Excel を使用して計算されました。 D'Agostino-Pearson および Kolmogorov-Smirnov 検定は、連続変数の正規分布を検定するために使用されました。連続変数と正規分布とのパラメトリック比較は、対応のない両側 t 検定を使用して実行されました。必要に応じて、ウェルチの補正を t 検定とともに使用して、不等サンプルサイズからの不等分散を考慮しました。 3 つのグループまたはそれ以上のグループ平均のパラメトリック比較は、ボンフェローニ事後検定を備えた一元配置または二元配置分散分析を使用して実行されました。クラスカル・ウォリス一元配置分散分析は、グループ全体に偏った分布と同様の広がりを持つ連続変数の分析に使用されました（補足図S1aと同様）。 2 つの連続変数間の関係は相関分析によって分析されました。データは平均±SEMまたは箱ひげ図として表示されます。 P < 0.05の場合、グループ間の差異は有意であるとみなされました。すべての分析は、GraphPad Prism 8.1 を使用して実行されました。

得られたデータの再現性を検証するために、異なる時点で複製を実行しました。 ELISA とウェスタンブロットは、2 人の異なるチームメンバーによって二重に実施されました。データは複製時に再現可能でした。すべてのヒト組織サンプルに対して観察者ブラインド分析が実行されました。この結果は、アルツハイマー病の病理/認知機能との関係を評価するために、ケンタッキー大学のアルツハイマー病センターに報告されました。研究者らは、組織学的分析のスコアリングや、偏見を防ぐための長期的な動物行動試験においても盲検化された。介入は同じ担当者によって行われたため、研究者は薬理学的介入（EC 細胞の amiR 処理など）または注射（AKO ラットへのヒトアミリン）中に盲検化されませんでした。ほとんどの生化学的アッセイでは、必要がないため、研究者は盲検化されませんでした。データ収集は、同じ設定の実験グループに対して同時に実行されました。

この原稿で使用されている抗体はすべて、メーカーやその他の出版物によって十分に確立されています。本研究ではアミリン抗体の検証を行いました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報ファイル内で入手できます。グラフの基礎となるソースデータは、「補足データ図」ファイルとして利用できます。トリミングおよび編集されていないボット画像は、補足図 6 として利用できます。すべての図のソースデータは、「補足データ 1」として単一の Excel ファイルで提供されます。この出版物で議論されている RNAseq データは NCBI の Gene Expression Omnibus に寄託されており、GEO シリーズのアクセッション番号 GSE221450 を通じてアクセスできます。

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糖尿病関連微小血管機能不全（ADAM）を軽減するためのケンタッキー大学研究同盟、国立衛生研究所 R01 NS116058、R01 AG057290、R01 AG053999、R01 HL 149127 および P30 AG028383、およびアルツハイマー病協会 VMF-15-363458 による資金の一部。英国認知症研究所。DRI Ltd から資金提供を受けており、英国医学研究評議会、アルツハイマー病協会、英国アルツハイマー病研究機関からの資金提供を受けています。 Medical Research Council (賞番号 MR/N026004/1); ウェルカムトラストハーディ (賞番号 202903/Z/16/Z); ドルビーファミリー基金; 国立衛生研究所研究大学ロンドン病院生物医学研究センター。 BRCNIHR ユニバーシティカレッジロンドン病院 NHS 財団トラストおよびユニバーシティカレッジロンドンの生物医学研究センター。 HL は、米国心臓協会のフェローシップ (18PRE33990154) によって支援されました。 TL は、英国アルツハイマー病研究シニアフェローシップによってサポートされています。 HZ は、スウェーデン研究評議会 (#2018-02532)、欧州研究評議会 (#681712 および #101053962)、スウェーデン国家臨床研究支援 (#ALFGBG-71320)、アルツハイマー創薬財団からの助成金によって支援されているワレンバーグ奨学生です。 (ADDF)、米国 (#201809-2016862)、AD 戦略基金およびアルツハイマー病協会 (#ADSF-21-831376-C、#ADSF-21-831381-C および #ADSF-21-831377-C)、オラフ・トーン財団、アーリング・ペルソン家族財団、スウェーデン、ヤルンフォンデンのStiftelsen för Gamla Tjänarinnor (#FO2019-0228)、マリー・スクウォドフスカとキュリーの助成金協定No 860197 (MIRIADE)に基づく欧州連合のHorizon 2020研究革新プログラム、欧州連合共同プログラム - 神経変性疾患研究 (JPND2021-00694)、および UCL の英国認知症研究所 (UKDRI-1003)。

Nirmal Verma、Gopal Viswanathan Velmurugan などの著者も同様に貢献しました。

米国ケンタッキー州レキシントンのケンタッキー大学薬理学栄養科学部

ニルマル・ヴェルマ、ゴパール・ヴィスワナサン・ヴェルムルガン、エドリック・ウィンフォード、ハン・コバーン、ディーパック・コティヤ、ノア・リーボルド、ローラ・ラドゥレスク、サンダ・デスパ、クイ・C・チェン＆フロリン・デスパ

ケンタッキー大学健康代謝研究センター（米国ケンタッキー州レキシントン）

ニルマル・ヴェルマ、ディーパック・コティヤ、ノア・リーボルド、ラウラ・ラドゥレスク、サンダ・デスパ、フロリン・デスパ

ケンタッキー大学神経科学学部、レキシントン、ケンタッキー州、米国

エドリック・ウィンフォード & フロリン・デスパ

UKHC ゲノミクス研究所、ケンタッキー大学、米国ケンタッキー州レキシントン

キューイ・C・チェン

サンダース・ブラウン老化センター、ケンタッキー大学、レキシントン、ケンタッキー州、米国

リンダ・J・ヴァン・エルディク、ピーター・T・ネルソン、ドナ・M・ウィルコック、グレゴリー・A・ジチャ

ケンタッキー大学生理学教室（米国ケンタッキー州レキシントン）

ドナ・M・ウィルコック

ケンタッキー大学神経内科、レキシントン、ケンタッキー州、米国

グレゴリー・A・ジチャ、アン・M・ストウ、ラリー・B・ゴールドスタイン、フローリン・デスパ

米国ケンタッキー州レキシントン、ケンタッキー大学磁気共鳴画像分光センター

デビッド・K・パウエル

米国カリフォルニア州デイビスのカリフォルニア大学 NMR 施設

ジェフリー・H・ウォルトン

カリフォルニア大学薬学部、デイビス、カリフォルニア州、米国

マヌエル・F・シャトル

ルイビル大学医学部、ルイビル、ケンタッキー州、米国

マシュー・A・ニストリアク

ケンブリッジ大学生理学・発達・神経科学学部、ケンブリッジ、CB2 3EG、英国

アンドリュー・J・マレー

ユトレヒト大学医療センター神経科、ユトレヒト、オランダ

ヘルト・ヤン・ビッセルズ

キングス・カレッジ・ロンドン、基礎および臨床神経科学部門、ロンドン、英国

クレア・トロクス

ヨーテボリ大学サールグレンスカアカデミー、神経科学・生理学研究所、精神医学および神経化学部門（スウェーデン、モルンダル）

ヘンリック・ゼッターバーグ

スウェーデン、モルンダルのサールグレンスカ大学病院、臨床神経化学研究室

ヘンリック・ゼッターバーグ

神経変性疾患部門、UCL クイーンスクエア神経学研究所、クイーンスクエア、ロンドン、WC1N 3BG、英国

ヘンリック・ゼッターバーグ、ジョン・ハーディ、タマリン・ラシュリー

UCL英国認知症研究所およびUCL神経変性疾患部門、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、ロンドン、英国

ヘンリック・ゼッターバーグ & ジョン・ハーディ

Reta Lila Weston Institute、UCL Queen Square Institute of Neurology、1 Wakefield Street、ロンドン、WC1N 1PJ、英国

ジョン・ハーディ

UCL運動障害センター、ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン、ロンドン、英国

ジョン・ハーディ

香港科技大学高等研究院、香港特別行政区、中国

ジョン・ハーディ

神経障害のためのクイーンスクエア脳バンク、UCL クイーンスクエア神経研究所、臨床運動神経科学部門、ロンドン、英国

タマリン・ラシュリー

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

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フロリン・デスパへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Chengbiao Wu ともう一人の匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Joao Valente。査読者レポートが利用可能です。

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Verma, N.、Velmurugan, GV、Winford, E. 他 Aβ 排出障害と炎症は、膵臓から分泌されるアミロイド形成アミリンの脳血管内蓄積に関連しています。 Commun Biol 6, 2 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04398-2

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受信日: 2022 年 7 月 8 日

受理日: 2022 年 12 月 21 日

公開日: 2023 年 1 月 3 日

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