分裂酵母 Srr1 および Skb1 はセントロメアでの同染色体形成を促進する

Apr 11, 2023

Communications Biology volume 6、記事番号: 551 (2023) この記事を引用

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Rad51 はゲノムの完全性を維持しますが、Rad52 は非標準的な相同組換えを引き起こし、全体的な染色体再構成 (GCR) を引き起こします。 今回我々は、分裂酵母のSrr1/Ber1とSkb1/PRMT5がセントロメアでGCRを促進することを発見した。 遺伝的および物理的分析により、srr1 および skb1 変異により、セントロメア逆方向反復によって媒介される同染色体形成が減少することが示されています。 srr1 は rad51 細胞の DNA 損傷感受性を高めますが、チェックポイント応答を無効にはしないことから、Srr1 が Rad51 非依存性の DNA 修復を促進することが示唆されます。 srr1 と rad52 は相加的に GCR を減少させますが、skb1 と rad52 は上位に GCR を減少させます。 srr1 や rad52 とは異なり、skb1 はダメージ感度を高めません。 Skb1は、それぞれSlf1およびPom1とともに細胞形態および細胞周期を調節するが、Slf1もPom1もGCRを引き起こさない。 Skb1 のアルギニン メチルトランスフェラーゼ ドメイン内の保存された残基を変異させると、GCR が大幅に減少します。 これらの結果は、Skb1 がアルギニンのメチル化を通じて異常な DNA 構造を形成し、Rad52 依存性 GCR を引き起こすことを示唆しています。 この研究により、セントロメアの GCR における Srr1 と Skb1 の役割が明らかになりました。

転座などの全体的な染色体再構成 (GCR) は、真核生物のゲノムに豊富かつ広範囲に存在する反復配列を使用して発生することがあります1。 ヒトでは、サテライトリピートや転移因子を含む反復配列の総数はゲノムの 54% を占めます 2,3。 GCR は細胞死や癌などの遺伝的障害を引き起こします。 一方で、GCR はゲノムの多様性を生み出すことで進化の原動力となる可能性があります4。 したがって、GCR は病理学的現象であるだけでなく、生理学的現象でもあります。

多くの真核生物では、染色体の適切な分離を保証するセントロメアに反復 DNA 配列が含まれています。 ヒトのセントロメア (3 Mb 以上) には、α サテライトおよび他のタイプのサテライト リピート、転移因子、および分節重複が含まれています。 αサテライトの高次リピートを含むセントロメアリピートの方向がセントロメア内で切り替わり、逆向きDNAリピートを形成します。 染色体の分離における重要な役割にもかかわらず、セントロメアは染色体の切断と再配列のホットスポットです6、7、8、9、10。 セントロメアでの反復配列間の組換えにより、異常な染色体が形成されます11、12、13。 セントロメアまたはその周囲での 2 本の先端動原性染色体の融合であるロバートソン転座は、ヒトで最も頻繁に観察される染色体異常の形態であり、新生児 1000 人に 1 人が罹患します 14。 腕が互いに鏡像になっている同染色体は、がん細胞でよく見られます15。 chr21 と chrX の同染色体は、それぞれダウン症候群とターナー症候群を引き起こします 16,17。 哺乳類のセントロメアと比較すると、分裂酵母 S. pombe セントロメアは短い (35 ～ 110 kb) ものの、非反復コア配列に隣接する逆向き DNA 反復が含まれています 18,19。 この真菌では、セントロメアの逆向き DNA 反復を使用して同染色体が生成されます 20、21、22。 セントロメア DNA 配列の複雑さが少ないため、分裂酵母はセントロメア GCR の機構を研究するための優れたシステムとなっています。

二本鎖切断などの有害な DNA 損傷を修復するには、相同組換えが必要です 23。 Rad51 は標準的な相同組換えの中心人物であり、相同性検索と DNA 鎖交換を触媒して置換ループを形成します。 哺乳類の BRCA1 および BRCA2 は Rad51 依存性組換えを促進し、その変異により GCR が増加し、保因者が癌になりやすくなります 24,25。 相同組換えによりセントロメアの完全性が維持されます。 哺乳類では、Rad51 が不活化するとセントロメアでの異常な組換えが増加します 9、10、26。 分裂酵母では、Rad51 の欠失によりセントロメアでの同染色体の形成が増加します 20、21、27。 分裂酵母を用いた詳細な分析により、Rad51 は保存的な組換え方法、つまりセントロメアでの非交差組換えを優先的に促進し、それによって同染色体形成を抑制することが示されました。

別のリコンビナーゼ Rad52 は、Rad5129 とは独立して、相同性に依存した DNA 組換え/修復を促進します。 Rad52 は、それ自体で、置換ループの形成、一本鎖アニーリング (SSA)、および RNA 鎖を使用した逆鎖交換を促進します。 酵母 Rad52 はまた、複製プロテイン A (RPA) でコーティングされた一本鎖 DNA への Rad51 のローディングを促進しますが、ヒト Rad52 にはローダー活性がありません 31。 哺乳類と分裂酵母の両方において、Rad52 依存性の非標準的組換えによりセントロメアで GCR が引き起こされます 9,32。 分裂酵母では、Rad52 は、クロスオーバー特異的エンドヌクレアーゼである Mus81 とのクロスオーバー組換えを介して同染色体形成を引き起こします 27、32、33、34、35。 PCNA のリジン 107 および Msh2-Msh3 でのユビキチン化は、Rad52 依存性 GCR 経路に関与していると考えられています 32,36。 PCNA K107 は DNA 損傷修復に不可欠であるため、DNA スライディング クランプ PCNA は、Rad52 依存性 GCR につながる DNA 構造を形成する可能性があります 36。 rad52 の欠失は同染色体形成を排除しないことから、Rad52 非依存性の GCR 経路の存在が示唆されます。 さらに、GCR を引き起こす最初のイベントは依然として不明です。

GCR メカニズムについての洞察を得るために、rad51Δ 変異株で GCR を引き起こす因子を検索し、Srr1 と Skb1 を見つけました。 シロイヌナズナとマウスでは、Srr1 ホモログは概日リズムに関与する遺伝子の転写に影響を与えます 37,38,39。 Skb1 は、分裂酵母の細胞形態や細胞周期制御などのさまざまな経路に関与しており 40、41、42、43、ヒトタンパク質アルギニンメチルトランスフェラーゼ 5 (PRMT5) のホモログです 44、45。 Srr1 および Skb1 は、同染色体形成を特異的に促進します。 注目すべきことに、srr1変異はDNA損傷感受性と染色体の喪失を増加させるが、DNA損傷に対するチェックポイント応答には必須ではないことから、Srr1がDNA損傷修復を促進することが示唆される。 srr1 と rad52 の変異は GCR 率を相加的に低下させ、Srr1 と Rad52 が GCR において重複する役割と重複しない役割を持っていることを示唆しています。 srr1 とは対照的に、skb1 の欠失は DNA 損傷感受性を増加させず、興味深いことに、rad51Δ 細胞における染色体の損失を減少させます。 細胞形態および細胞周期調節においてSkb1とともに機能するSlf140,41またはPom142,43の喪失は、GCRを減少させなかった。 しかし、Skb1 のアルギニンメチルトランスフェラーゼ (RMTase) ドメインの保存残基を変異させると GCR が大幅に減少し、Skb1 がその RMTase 活性を通じて同染色体形成を引き起こすことが示唆されました。 これらの発見は、セントロメアにおける GCR イベントのメカニズムを解読するための新たな道を切り開きます。

GCR のメカニズムについての洞察を得るために、GCR 率の上昇を示すランダム変異を rad51Δ 細胞に導入し、GCR レベルの低下を示すクローンを検索しました。 一倍体細胞内の致死的 GCR を検出するために、分裂酵母 3 番染色体 (chr3) に由来する染色体外 ChLC (約 530 kb) を使用し、ura4+ および ade6+ マーカー遺伝子を失った自然発生的 GCR を検出しました (図 1a)20,27。 、46。 GCR率を評価するために、ウラシルとアデニンを補充したエディンバラ最小培地（EMM+UA）で増殖させた酵母クローンを、ura4+細胞に対して毒性のある5-フルオロオロチン酸（5-FOA+UA）を含む培地に複製しました。 24,000 クローンのうち、3 つが再現性よく GCR レベルの低下を示しました。 それらのうちの1つのゲノム配列決定により、SRR1様ドメインとアルギニンメチルトランスフェラーゼ（RMTase）ドメインにそれぞれsrr1/ber1-W157Rとskb1-A377Vの変異が同定されました（図1b）。 srr1 遺伝子と skb1 遺伝子は、chr2 上で互いにわずか 51 kb 離れています。 レプリカプレーティングアッセイは、親のrad51Δ株と比較して、5-FOA+UAプレート上のコロニー数が減少したことからsrr1およびskb1変異を含むrad51Δクローンを示す（図1c）。

a この研究で GCR を検出するために使用された染色体外 ChLC が示されています。 Leu+ Ura+ Ade+ から Leu+ Ura- Ade- を生じる GCR が検出されました。 b Srr1/Ber1 タンパク質と Skb1 タンパク質には、それぞれ SRR1 様ドメインとアルギニン メチルトランスフェラーゼ (RMTase) ドメインが含まれています。 異なる種の srr1-W157R および skb1-A377V 変異 (青い丸) の周囲のアミノ酸配列を並べています。 異なる種間で類似および同一の残基は、それぞれ淡い灰色と濃い灰色で強調表示されます。 c EMM + UA上で増殖させた親rad51Δ株とsrr1-W157Rおよびskb1-A377V変異（TNF5411および5954）をさらに含むクローンを5-FOA+UAプレート上に複製しました。 Leu+ Ura- 細胞は、5-FOA+UA プレート上で選択的にコロニーを形成します。 d 野生型、srr1Δ、skb1Δ、rad51Δ、srr1Δrad51Δ、skb1Δrad51Δ、およびsrr1Δskb1Δrad51Δ株（TNF5369、5774、5772、5411、5904）のGCR率、5788、および8432 ）。 e 野生型、rad51Δ、srr1Δ rad51Δ、srr1-W157R rad51Δ (TNF8344)、skb1Δ rad51Δ、skb1-A377V rad51Δ (TNF8359)、および srr1-W157R skb1-A3 の GCR 率77V rad51Δ (TNF8547) ）。 各ドットは、独立した実験から得られた値を表します。 黒い線は中央値を示します。 野生型と比較した比率が各ドットクラスターの上部に表示されます。 野生型株と変異株の間、および指定されたペアの間の両側マン・ホイットニー検定。 ns、有意ではない。 **p < 0.01; ***p < 0.001; ****、p < 0.0001。 グラフ d および e の基礎となる数値データは、補足データ 1 の表 A に示されています。

Srr1またはSkb1がGCRに必要であるかどうかを確立するために、遺伝子を削除し、変動テストによってGCR率を決定しました（図1d）。 野生型バックグラウンドでは、srr1ΔはGCR率をわずかに減少させたが、skb1Δは減少させなかった。これは、Rad51の存在下でもGCRにSrr1が必要であることを示している。 驚いたことに、srr1Δだけでなくskb1Δもrad51ΔバックグラウンドにおけるGCR率を低下させ、Srr1とSkb1の両方がGCRを引き起こすことが実証された。 注目すべきことに、srr1Δ skb1Δ二重変異は単一変異よりもGCRをさらに減少させ、Srr1とSkb1がGCRにおいて重複しない役割を担っていることを示唆している（以下を参照）。 srr1-W157Rおよびskb1-A377V点突然変異がGCR率を低下させるかどうかを判断するために、形質転換によって各突然変異を酵母に導入し（方法を参照）、rad51ΔバックグラウンドでGCR率を決定しました（図1e）。 srr1-W157R は、srr1Δ ほど顕著ではないものの、GCR 率を低下させ、Srr1 変異タンパク質の活性が残っていることを示唆しています。 skb1Δとは異なり、skb1-A377Vはsrr1+rad51Δ細胞においてGCR率を有意に低下させなかった。 しかし、skb1-A377Vはsrr1-W157R rad51Δ細胞におけるGCR率を低下させ、skb1-A377VがSkb1機能を部分的に不活化することを示唆している。 GCR 率に対する srr1-W157R と skb1-A377V の相加効果は、なぜ我々の遺伝子スクリーニングで同じクローン内で両方の変異が同定されたのかを説明できます。 これらの結果は、Srr1 と Skb1 が GCR において重複しない役割を果たしているという考えと一致しています。

出芽酵母 srr1/ber1Δ (ベノミル耐性) 細胞は、微小管を不安定にするベンゾイミダゾール化合物、ベノミルおよびノコダゾールに対して非常に耐性があります 39。 ただし、分裂酵母 srr1Δ 細胞は、この真菌で使用される最も一般的なベンズイミダゾールであるチアベンダゾール (TBZ) に対して野生型と同じ耐性しかありませんでした (補足図 1)。 これに基づいて、混乱を避けるために、この遺伝子を ber1 ではなく srr1 と呼ぶことにしました。

以前の研究では、rad51Δ 細胞が同染色体を生成し、染色体の切断が比較的少ないことが示されています 27、32、36。 アイソ染色体はセントロメアでの逆向きDNA反復を使用して生成されますが、染色体切断は新しい染色体末端へのテロメア配列の新規付加によって形成されます（図2a）。 同染色体 (300 ～ 400 kb) と切断型 (< 220 kb) は、その長さによって区別されます。 どのGCR Srr1とSkb1が原因であるかを決定するために、親GCRクローンと独立したGCRクローンの染色体DNAをアガロースプラグで調製し、パルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）で分離し、臭化エチジウムで染色しました（図2b）。 GCR 産物のサイズは、親 ChLC (530 kb) およびラムダ (λ) DNA ラダーを参照として使用して決定されました。 以前に観察されたように、rad51Δ 細胞は多くの同染色体 (300 ～ 400 kb) と少数の切断 (< 220 kb) を生成しました 20、27、32、36。 Srr1 または Skb1 の欠失により、GCR 産物中の同染色体の割合が減少しました。 総GCR率に同染色体または切断の割合を乗算し（表1）、同染色体および切断の割合をそれぞれ求めました（図2c）。 srr1Δ または skb1Δ は、rad51Δ 細胞で形成された同染色体の約 90% を除去しましたが、どちらも染色体の切断を減少させませんでした。 これらのデータは、Srr1 と Skb1 がセントロメアでの同染色体形成に特に必要であることを示しています。

a cen3 の非反復シーケンス (cnt3) と反復シーケンス (最も内側の imr3、dg、dh、および最も外側の irc3) が示されています。 ura4+ マーカー遺伝子は、cen3 から 10 kb に位置します。 Rad51 が失われると、同染色体と染色体の切断が増加します。 b rad51Δ、srr1Δ rad51Δ、および skb1Δ rad51Δ 株 (TNF5411、5904、および 5788) の親 (P) および独立 GCR クローンから調製した染色体 DNA を PFGE によって分離しました。 ラムダ (λ) DNA ラダーのサイズはパネルの左側に示されています。 同染色体と切断のサンプル番号は、それぞれ青と赤紫で示されています。 c 野生型 (TNF5369)、rad51Δ、srr1Δ rad51Δ、skb1Δ rad51Δ、および skb1-F319Y rad51Δ (TNF8391) 株における同染色体形成および染色体切断の速度。 rad51Δ株に対する比率はバーの上部に示されています。 rad51Δ と他の変異株の間の両側フィッシャー直接確率検定。 **p < 0.01; ****p < 0.0001。 cの基礎となる数値データは、補足データ1の表Bに提供されています。トリミングされていないゲル画像は補足図5に示されています。

Srr1 と Skb1 はセントロメア反復を介して同染色体形成を促進するため、DNA 損傷の組換え修復に関与している可能性があります。 この可能性をテストするために、段階希釈アッセイを実行し、DNA損傷因子に対するsrr1およびskb1変異株の感受性を決定しました（図3a）。 メタンスルホン酸メチル (MMS) は DNA アルキル化剤です。 ヒドロキシ尿素 (HU) は dNTP プールを枯渇させます。 カンプトテシン (CPT) はトポイソメラーゼ阻害剤です。 これらの物質は複製フォークの進行を妨害し、DNA 切断を引き起こします。 野生型と比較して、srr1Δ細胞はすべてのDNA損傷因子に対して過敏性を示しました（図3a、上のパネル）。 注目すべきことに、srr1Δ rad51Δ細胞は単一変異体よりも感受性が高く、Rad51非依存性のDNA損傷応答におけるSrr1の役割が示唆された。 GCR率を部分的に低下させるsrr1-W157R変異（図1e）は、損傷感受性も部分的に増加しました。 これらの結果は、Srr1 が Rad51 非依存性の DNA 損傷応答を促進することを示唆しています。

a DNA 損傷因子に対する感受性を決定するための段階希釈アッセイ。 YE3S 培地で調製した野生型、srr1-W157R、srr1Δ、rad51Δ、srr1-W157R rad51Δ、および srr1Δ rad51Δ (TNF3885、8280、5847、5845、8573、および 5849) の対数期培養物を、 MMS、HU、または CPT の示された濃度 (上のパネル)。 YE培地で調製した野生型、skb1Δ、rad51Δ、およびskb1Δ rad51Δ（TNF35、8321、8107、および8320）の対数期培養物をYEプレート上にスポットしました（下のパネル）。 b EMM の対数期にある野生型、srr1Δ、skb1Δ、および chk1Δ 細胞 (TNF35、5943、8321、および 3559) を 0.01% MMS で処理しました。 隔壁を含む細胞の割合が示されています。 > 300 個のセルが各ポイントでカウントされます。 t = 8 時間における野生型と他の株の間の分離指数のピアソンのカイ二乗検定では、srr1Δ または skb1Δ は分離指数を有意に変化させなかったが (p > 0.05)、chk1Δ はそれを増加させたことが示されました。 c MMS 処理に応答した Chk1 リン酸化。 0.01% MMS での 4 時間の処理の前後に、野生型、srr1Δ、および skb1Δ (TNF8441、8799、および 8802) の chk1+ (TNF7555) および chk1-HA+ 細胞から抽出物を調製し、8% SDS-PAGE で分離しました。 Chk1-HAは、抗HA抗体(16B12)を使用したウェスタンブロッティングによって検出されました。 クマシーブリリアントブルーを使用してタンパク質全体を染色しました。 サイズマーカー（Takara、3454 A、CLEARLY 染色されたタンパク質ラダー）を左側に示します。 重量、野生型。 トリミングされていない画像を補足図6に示します。 d 野生型およびsrr1Δ（TNF5369および5774）細胞をアデニン制限YEプレートにプレーティングし、その上でade6-細胞が赤いコロニーを形成しました。 e 野生型、srr1Δ、srr1-W157R、skb1Δ、rad51Δ、srr1-W157R rad51Δ、およびskb1Δ rad51Δ株（TNF5369、5774、8308、5772、5411、8344、および5788）の染色体喪失率。 両側マンホイットニー検定。 **p < 0.01; ***p < 0.001。 b、eの基礎となる数値データは、補足データ1の表CおよびDにそれぞれ提供されます。

DNA損傷チェックポイントによって引き起こされる細胞周期の停止は、細胞にDNAを修復する時間を与えます。 DNA損傷に応答して細胞周期の進行を阻止するのにSrr1が必要かどうかを判断するために、MMSへの曝露の前後で隔てられた細胞の割合を決定しました（図3b）。 野生型では、MMS 曝露後、分離指数が約 30 ％から 5％ に低下し、MMS 誘発性の細胞周期停止が実証されました。 チェックポイントキナーゼ Chk1 は、細胞周期の停止に必要です 47。 chk1Δ 株では、分離指数は野生型レベルまで低下しませんでした。 chk1Δとは異なり、srr1Δ株では、MMS添加後6時間までに分離指数が野生型レベルまで低下し、Srr1が細胞周期停止には必要ないことが示唆された。 隔壁細胞の減少の遅れは、srr1Δ 株の増殖が遅いことが原因である可能性があります。 30℃のEMM培地で増殖させた野生型細胞とsrr1Δ細胞の倍加時間は、それぞれ2.48±0.11時間と2.73±0.10時間でした（p = 0.042、両側スチューデントt検定）（補足データ1の表E） ）。 野生型細胞と同様に、srr1Δ細胞はMMS曝露後に伸長しました（補足図2a）。 これらのデータは、Srr1 が DNA 損傷誘発性の細胞周期停止には不要であることを示唆しています。 Chk1 キナーゼは、DNA 損傷に応答してリン酸化され、活性化されます 48,49。 Srr1がChk1リン酸化に必要かどうかを判断するために、HAタグ付きChk1-HAを元の染色体座から発現させ、SDS-PAGEで分離し、抗HA抗体を使用して検出しました（図3c）。 野生型株と srr1Δ 株の両方で MMS 処理すると、リン酸化 48 を示すゆっくりと移動する Chk1-HA バンドが観察され、Srr1 が DNA 損傷チェックポイントの活性化に必須ではないことが示されました。

自然発生的な DNA 損傷の修復は、染色体を維持するために不可欠です。 Srr1 が染色体の維持に必要かどうかを判断するために、変動テストによって ChLC の自然消失率を測定しました。 YE3S プレート上に形成されたコロニーを滅菌水に懸濁し、細胞をアデニン制限 YE プレート上に播種すると、ade6+ を欠く細胞が赤色コロニーを形成しました 50 (図 3d)。 赤色コロニーをさらに Leu および Ura 栄養要求性について検査して、染色体喪失率（つまり、Leu-Ura-Ade-）を取得しました（図 3e）。 srr1Δ と srr1-W157R が染色体の喪失率を増加させることがわかりました。 以前に観察されたように、rad51Δ は染色体の喪失も増加させます 32。 注目すべきことに、srr1-W157Rとrad51Δは相乗的に染色体の喪失を増加させ、Srr1とRad51が染色体の維持において異なる役割を果たしていることが実証された。

srr1変異とは対照的に、skb1ΔはRad51の存在下でも非存在下でもDNA損傷因子に対する感受性を増加させなかった（図3a、下のパネル）。これは、MMS、HU、またはCPT。 Skb1はまた、MMS処理によって誘導される細胞周期停止およびChk1リン酸化にも不要でした（図3b、c）。 しかし、興味深いことに、skb1Δはrad51Δ細胞における染色体の喪失を強力に減少させ（図3e）、Skb1がrad51Δ細胞において同染色体形成と染色体の喪失を引き起こすことを示しています。

Rad52 は、rad51Δ 細胞における同染色体形成を促進します。 N末端DNA結合ドメインのrad52-R45K変異は、in vitroでの一本鎖アニーリング（SSA）活性を特異的に損ない、rad52Δ32と同程度に同染色体形成を減少させることから、同染色体形成におけるRad52媒介SSAの役割が示唆されている。 rad52-R45K、rad52Δ、およびsrr1Δの変異により、rad51Δ細胞の同染色体の約90％が除去され（図2cおよび参考文献32）、Rad52とSrr1の両方が同染色体形成の主要経路に必須であることが示されています。 Srr1とRad52の関係を定義するために、srr1 rad52二重変異体を作成し、GCR率を決定しました（図4a）。 注目すべきことに、srr1Δとrad52-R45Kは野生型バックグラウンドにおけるGCR率を相加的に低下させ、Srr1とRad52もGCRにおいて重複しない役割を担っていることが示唆された。 この考えと一致して、srr1-W157R と rad52-R45K は、rad51Δ バックグラウンドでの GCR 率を相加的に減少させました。 PCNA (pcn1 遺伝子によってコードされる) のリジン 107 (K107) でのユビキチン化は、Rad52 依存性 GCR で役割を果たします 36。 予想通り、srr1-W157Rおよびpcn1-K107Rも、rad51Δ細胞におけるGCR率を相加的に低下させた（図4a）。 これらのデータは、Srr1 と Rad52 が GCR において重複する役割と重複しない役割の両方を持っていることを示しています。

a 野生型の GCR 率、srr1Δ、rad52-R45K、srr1Δ rad52-R45K、rad51Δ、srr1-W157R rad51Δ、rad52-R45K rad51Δ、srr1-W157R rad52-R45K rad51Δ、 pcn1-K107R rad51Δ 、および srr1-W157R pcn1-K107R rad51Δ 株 (TNF5369、5774、6599、8281、5411、8344、7122、8663、6761、および 8601)。 両側マンホイットニー検定。 b srr1∆ と rad52∆ の四分子分析。 srr1::kanR および rad52::hygR 半数体 (TNF5943 および 7988) を交配し、得られた四分子を YE プレート上で顕微鏡下で解剖しました。 srr1::kanR rad52::hygR 子孫がコロニーを形成しなかった 3 つの胞子の生存可能な四分子の 3 セットの画像が示されています。 c AID システムによる Rad52 の枯渇は、srr1Δ 細胞の増殖を阻害します。 rad52-AID、srr1∆ rad52-AID、OsTIRF74A、srr1∆ OsTIRF74A、rad52-AID OsTIRF74A、および srr1∆ rad52-AID OsTIRF74A (TNF8614、8621、8616、8623、8617、および 8627) 200を補充したYEプレートにスポットしたRad52 枯渇を誘導する nM 5'a-IAA。 d Rpa2-mCherry 病巣 (矢印) は、野生型細胞 (TNF5492) の蛍光顕微鏡によって観察されました。 蛍光画像とDIC画像を重ねて表示します。 DIC、微分干渉コントラスト。 画像の下に表示されているバーは 10 μm を示します。 棒グラフは、野生型および srr1Δ (TNF8803) 株における少なくとも 1 つの Rpa2-mCherry 焦点を含む核のパーセンテージを示します。 バーは 3 回の独立した実験の平均を表します。 両側スチューデントの t 検定。 e Rad52-GFP 焦点 (矢印) が野生型細胞 (TNF4442) で観察されました。 棒グラフは、野生型および srr1Δ (TNF6130) 株における少なくとも 1 つの Rad52-GFP フォーカスを含む核のパーセンテージを示します。 a の基礎となる数値データは表 A に示され、d および e の基礎となる数値データは補足データ 1 の表 F に示されます。

srr1Δおよびrad52Δ半数体株を交配し、四分体を解剖しましたが、srr1Δ rad52Δ子孫を取得できませんでした（図4b）。これは、srr1 rad52二重欠失の合成増殖欠陥を示唆しています。 これを確認するために、オーキシン誘導デグロン 2 (AID2) システムを使用して srr1Δ 細胞の Rad52 を枯渇させました 51。 F-box タンパク質 OsTIR1F74A の存在下では、オーキシン類似体 5'-アダマンチル-IAA (5'a-IAA) が、AID タグ付き Rad52 タンパク質 Rad52-AID のポリユビキチン依存性分解を誘導します。 培地への5'a-IAAの添加は、rad52-AID株と比較して、srr1Δ rad52-AIDの細胞増殖を著しく阻害した(図4c、最後の2行)。 これらの結果は、細胞増殖における Srr1 と Rad52 の役割が重複していないことを示しています。 DNA損傷因子に対するsrr1Δ細胞の過敏性を考慮すると（図3a）、Srr1は自然発生的なDNA損傷の修復を促進する可能性があります。 一本鎖 DNA は、複製、転写、および DNA 損傷の修復/組換え中に形成されます。 複製プロテイン A (RPA) 複合体は、高い親和性で一本鎖 DNA に結合します 52。 元の染色体遺伝子座から発現されたRpa2-mCherryの自発的焦点形成を検出しました32、srr1ΔがRpa2-mCherry焦点を含む細胞の割合を増加させることがわかりました（図4d）。これは、srr1Δ細胞における一本鎖DNAの蓄積を示唆しています。 Rad52 は自然発生的な DNA 損傷部位に核病巣を形成します 27,53。 srr1Δは、Rad52-GFPフォーカスを含む細胞も増加させ（図4e）、Srr1がRad52フォーカスの形成を抑制することを示しています。

Srr1には、SRR1様ドメインと呼ばれる進化的に保存されたドメインがあります（図5a）。 AlphaFold 法によって予測される Srr1 タンパク質構造 54、55 は、N 末端と C 末端の両方で本質的に無秩序な伸長 56 を持つ α ヘリックスに挟まれた β シートを含む SRR1 様ドメインから構成されます (図 5b、c)。 srr1-W157R 変異部位は SRR1 様ドメインに存在します。 これを拡張するために、SRR1様ドメインの保存残基をアラニンに変更しました：srr1-D111A、P112A、およびsrr1-H148A（図5a、b）。 srr1-D111A、P112Aおよびsrr1-H148A変異は両方ともGCR率を低下させた（図5d）。 srr1-D111A、P112A、およびsrr1-H148AもDNA損傷感受性を増加させました（図5e）。 これらの結果は、SRR1 様ドメインが GCR および DNA 損傷修復において重要な役割を果たしていることを示しています。 倍加時間の延長から予想されるように（補足データ 1 の表 E）、srr1Δ 細胞は野生型細胞と比較してプレート培地上に小さなコロニーを形成しました（補足図 2b）。 srr1Δ細胞と同様に、srr1-W157R、srr1-D111A、P112A、およびsrr1-H184A細胞は小さなコロニーを生成しました（補足図2b）。これは、外因性DNA損傷がない場合でもSRR1様ドメインの役割と一致しています。

a 分裂酵母 srr1-D111A、P112A、-H148A、-W157R の変異部位の位置を青い丸で示します。 異なる種間で類似および同一の残基は、それぞれ淡い灰色と濃い灰色で強調表示されます。 b AlphaFold メソッドによって予測された Srr1 構造のリボン モデル。 変異部位の位置が示されています。 c Srr1 構造の表面モデル。 正に帯電した残基は青で、負に帯電した残基は赤で表示されます。 d 野生型、rad51Δ、srr1Δ rad51Δ、srr1-W157R rad51Δ、srr1-D111A、P112A rad51Δ、および srr1-H148A rad51Δの GCR 率 (TNF5369、5411、5904、8344) 、8686、8387) 。 両側マンホイットニー検定。 数値データは、補足データ 1 の表 A に提供されています。 e SRR1 様ドメイン内の保存された残基を変異させると、MMS、HU、および CPT に対する感受性が増加します。 野生型、srr1Δ、srr1-W157R、srr1-H148A、および srr1-D111A,P112A (TNF3885、5847、8280、8275、および 8274) 細胞を、指定された濃度の MMS、HU、または CPT を補充した YE3S 上にスポットしました。 。

Skb1 は、細胞形態や細胞周期制御などの幅広い経路に関与していると考えられています。 Skb1 は Slf1 と相互作用し、Slf1 に応じて細胞皮質節に局在し、分裂酵母の桿状細胞形態を促進します 40,41。 DYRK ファミリーキナーゼ Pom1 は、細胞周期の進行を負に制御して、細胞が有糸分裂に入る前に確実に一定のサイズまで成長するようにします 42。 遺伝的証拠は、Skb1 が Pom1 経路で作用して、そのメチルトランスフェラーゼ活性とは独立して細胞周期を調節することを示しています 43。 Skb1がこれらの経路を通じて同染色体形成を促進するかどうかを調べるために、slf1またはpom1遺伝子を破壊し、変異株のGCR率を測定しました（図6a）。 skb1Δとは異なり、slf1Δおよびpom1Δは野生型バックグラウンドでGCR率をわずかに増加させたが、rad51ΔバックグラウンドではGCR率を低下させず、Skb1がSlf1またはPom1とは独立した機能を通じて同染色体形成を促進することを示した。

a 野生型、skb1Δ、slf1Δ、pom1Δ、rad51Δ、skb1Δrad51Δ、slf1Δrad51Δ、およびpom1Δrad51Δ株（TNF5369、5772、8811、8813、5411、 5788、8834 、8838）。 b AlphaFold法によって予測された分裂酵母S.ポンベSkb1のアルギニンメチルトランスフェラーゼドメインの構造と、SAM類似体であるSAHを含むC.エレガンスPRMT5（PDBコード3UA3）のアルギニンメチルトランスフェラーゼドメインの結晶構造が示されています。 アルギニンメチルトランスフェラーゼ活性に必須のフェニルアラニン (F) およびグルタミン酸 (E) 残基の位置が示されています。 c 野生型、rad51Δ、skb1Δ rad51Δ、skb1-A377V rad51Δ、skb1-F319Y rad51Δ、および skb1-E422A、E431A rad51Δ 株の GCR 率 (TNF5369、5411、5788、83) 59、8391、8474 ）。 d PFGEは、skb1-F319Y rad51Δ株のGCR産物を分離しました。 同染色体と切断のサンプル番号は、それぞれ青と赤紫で示されています。 e 野生型、skb1Δ、rad52-R45K、skb1Δ rad52-R45K、rad51Δ、skb1Δ rad51Δ、rad52-R45K rad51Δ、および skb1Δ rad52-R45K rad51Δ 株の GCR 率 (TNF5) 369、5772、6599 、8324、5411、5788、7122、および8345）。 両側マンホイットニー検定。 a、c、および e の基礎となる数値データは、補足データ 1 の表 A に提供されています。トリミングされていないゲル画像は補足図 5 に示されています。

Skb1 は PRMT5 アルギニン メチルトランスフェラーゼ (RMTase) のホモログです 44,45。 AlphaFold 法によって予測された S. pombe Skb1 の RMTase ドメイン構造 54,55 は、C. elegans PRMT5 RMTase ドメインの結晶構造 (図 6b)、および H. sapiens、A. thaliana、S. thaliana の予測構造と非常によく似ています。 . cerevisiae Skb1/PRMT5 ホモログ（補足図 3）。 我々が単離したskb1-A377V変異はRMTaseドメインに存在するが（図1b、6b）、変異表現型はskb1Δほど顕著ではなかった（図6c）。 RMTase 活性が Skb1 の同染色体形成促進に必須であるかどうかを調べるために、C. elegans PRMT557 の in vitro RMTase 活性に重要な残基と同等の Skb1 残基 F319、E422、および E431 を変異させました。 我々は、skb1-F319Yおよびskb1-E422A、E431A変異がrad51Δ細胞におけるGCR率を強く低下させることを発見した（図6c）。 重要なことに、同じ skb1-E422A、E431A 変異は細胞周期制御における役割を妨げません 43。 PFGE分析により、skb1Δと同様に、skb1-F319Yはrad51Δ細胞において同染色体を減少させるが、染色体切断は減少させないことが示された（図2c、6d、および表1）。 また、Skb1とRad52の関係を調べたところ、skb1Δがrad52-R45Kまたはrad52-R45K rad51Δ細胞のGCR率を有意に低下させないことがわかりました（図6e）。 まとめると、これらのデータは、Skb1 がその RMTase 活性を介して Rad52 依存性の同染色体形成を促進することを示しています。

GCR は、真核生物のゲノムに存在する反復配列を使用して発生します。 しかし、リピート媒介 GCR のメカニズムはほとんど知られていません。 今回、我々は進化的に保存されたSrr1とSkb1がセントロメアの逆向きDNA反復を利用して同染色体形成を促進することを発見した。 注目すべきことに、srr1はrad51Δ細胞におけるDNA損傷感受性を増加させたが、チェックポイント応答を廃止しなかったことから、Srr1がGCRを起こしやすいRad51非依存性のDNA修復を促進することが示唆された。 srr1 と rad52 の変異は相加的に減少しましたが、skb1 と rad52 は顕著に GCR 率を減少させました。 srr1 変異とは対照的に、skb1Δ は rad51Δ 細胞における DNA 損傷感受性を増加させず、染色体の損失を減少させました。 RMTase 活性を通じて、Skb1 は Rad52 依存性 GCR につながる DNA 構造を形成する可能性があります。

Srr1 と Skb1 はセントロメアでの同染色体形成を促進します。 我々は、GCRレベルの低下を示すsrr1-W157Rおよびskb1-A377V変異を同じクローン内で発見した（図1c）。 srr1またはskb1のいずれかの欠失により、rad51Δ細胞のGCR率が低下し（図1d）、Srr1とSkb1の両方がGCRを促進することが示されました。 Rad51の存在下でもsrr1ΔはGCR速度を低下させたがskb1Δは低下させなかったため、Srr1はSkb1よりもGCRに不可欠であると思われる（図1d）。 GCR産物の物理的分析により、Srr1とSkb1はrad51Δ細胞で産生される同染色体の約90％に関与しているが、染色体切断には必要ないことが示されました（図2c）。 同染色体の切断点がセントロメアリピート20に存在するという事実を考慮すると、これらの結果は、Srr1およびSkb1がセントロメアでのリピート媒介GCRを促進することを示しています。 Srr1 または Skb1 がセントロメア外で GCR を引き起こすかどうかはまだ解明されていません。 srr1とskb1の変異は、rad51Δ細胞のGCR率を相加的に低下させ（図1d、e）、Srr1とSkb1がGCRにおいて重複しない役割を担っていることを示唆しています（以下を参照）。

Srr1 はどのようにして同染色体形成を促進するのでしょうか? 私たちは、Srr1 が GCR の影響を受けやすい DNA 損傷の修復を促進すると考えています。 野生型では、Rad51 は主に DNA 二本鎖切断などの有害な DNA 損傷を修復し、染色体の完全性を保護します。 しかし、Rad51 が存在しない場合、修復されずに残された DNA 損傷は、Rad52 依存性組換え経路などの他の修復経路に誘導されます 29,30。 srr1とrad51の変異はMMS、HU、またはCPTに対する感受性を相加的に増加させるため、Srr1はRad51非依存性のDNA損傷応答に関与しています（図3a、5e）。 Srr1はMMS誘導性の細胞周期停止とChk1リン酸化には必須ではなかった（図3b、c）。これは、Srr1がチェックポイント応答ではなくDNA損傷修復を促進することを示唆している。 これは、チェックポイントキナーゼ Chk1 および Rad3 が GCR を抑制するが促進しないという事実と一致しています 20,58。 rad52Δおよびrad52-R45K32と同様に、srr1Δはrad51Δ細胞の同染色体の約90％を除去し（図2c）、Srr1とRad52が同染色体形成の主要経路に必須であることが示されました。 ただし、srr1とrad52の変異によりGCR率が相加的に低下したため、Srr1とRad52はGCRにおいて重複しない役割も担っている可能性があります（図4a）。 これは、GCR率に対するsrr1とskb1の相加効果（図1d、e）、およびskb1とrad52の上位効果（図6e）によって裏付けられています。 srr1Δは、rad52Δによる合成成長欠陥を引き起こし、Rpa2およびRad52の自発的病巣を蓄積しました（図4b-e）。 srr1Δは、野生型と比較して倍加時間を増加させ、小さなコロニーを生成しました（補足データ1の表E、補足図2b）。 Srr1 は自然発生的な DNA 損傷の修復を促進する可能性があります。 DNA 損傷因子に対する srr1 細胞の過敏性はこれを裏付けていますが、Srr1 が自然発生的な DNA 損傷の形成を抑制する可能性を排除するわけではありません。 その生化学的機能は不明のままですが、我々は、GCR と DNA 損傷修復に重要な SRR1 様ドメインを発見しました。 SRR1 様ドメインの進化的に保存された残基を変更する srr1-D111A、P112A、および srr1-H148A 変異は、GCR 率を大幅に低下させ、フォークの進行を妨げ、最終的に DNA 切断を引き起こす DNA 損傷因子に対する感受性を高めました (図 5)。 ）。 Srr1 の N 末端伸長は、参考文献で本質的に無秩序であると予測されています。 56 であり、分裂酵母やヒトを含む他の生物には正に帯電した残基が含まれており、他の分子との相互作用におけるその役割を示唆しています。 興味深いことに、Dali サーバーを使用したタンパク質構造の比較 59 は、SRR1 様ドメインがメチルトランスフェラーゼを含む一連のタンパク質と構造的類似性を持っていることを示唆しています (補足データ 2)。 マウス細胞における Srr1 ホモログ SRRD のノックアウトは DNA 複製を損なう 37 ことから、哺乳類の Srr1 は DNA 複製中に生じる自然発生的な DNA 損傷の修復にも役割を果たしていることが示唆されます。 植物および哺乳類では、SRR1/SRRD は概日リズムに関与する遺伝子の転写に影響を及ぼし 37,38,60 、Srr1 が転写制御を通じて GCR および DNA 損傷応答を促進する可能性が高まっています。 興味深いことに、出芽酵母における srr1/ber1 変異は、セントロメア特異的ヒストン H3 変異体 Cse4/CENP-A39 などのセントロメアタンパク質の変異を伴う合成増殖欠陥を引き起こします。 出芽酵母 srr1Δ/ber1Δ 細胞とは異なり、分裂酵母 srr1Δ 細胞は微小管不安定化薬剤に対して過剰耐性ではありませんでしたが、Srr1 がセントロメア構造に影響を与えることにより同染色体形成を促進する可能性は依然としてあります。 Srr1 は分裂酵母では核とサイトゾルの両方に局在していることがわかっています 61 が、Srr1 がセントロメアに局在しているかどうかは不明のままです。 Srr1 がどのように同染色体形成と DNA 損傷応答を促進するかを解明するには、今後の研究が必要です。

Fbh1 ヘリカーゼの変異が rad52Δ 細胞の増殖と組換え欠陥を抑制することが示されており 62、自然発生的な fbh1 変異が rad52Δ 株に導入され、GCR に影響を与えている可能性が高まっています。 しかし、我々は以前、GCR 率の決定に使用した rad52Δ rad51Δ 株 36 に fbh1 変異がないことを示しました。 また、この研究で使用したすべての rad52 変異株および srr1Δ rad51Δ 株に fbh1 変異がないことも確認しました (補足データ 3)。 さらに、fbh1欠失は、rad51Δ細胞における同染色体形成に大きな影響を与えませんでした（補足図4）。

Skb1 は多くの経路に関与していると考えられています。 しかし、我々のデータは、Skb1が、それぞれSlf1およびPom1によって媒介される細胞形態および細胞周期調節における役割とは無関係に、同染色体形成を促進することを示している（図6a）。 Skb1 と Slf1 は相互に結合し、細胞皮質節への局在化に相互に必要とされます 40。 slf1ΔはGCR率を低下させなかったので、皮質リンパ節局在はSkb1が同染色体形成を促進するために必須ではない。 rad51Δ 細胞では、rad52-R45K が同染色体形成を減少させ、DNA 損傷感受性を高めます 32。 DNA スライディング クランプ PCNA および rad52-R45K における pcn1-K107R 変異は同染色体形成をエピスタティックに減少させますが、pcn1-K107R は DNA 損傷感受性を増加させません 36。 pcn1-K107Rと同様に、skb1ΔはRad52依存性の同染色体形成を阻害しますが（図6e）、DNA損傷感受性は増加しません（図3a）。 Skb1 は PCNA と協力して、Rad52 依存性 GCR につながる DNA 構造を形成する可能性があります。 rad51Δ 細胞は、おそらく自然発生的な DNA 損傷を修復できないため、染色体喪失および GCR レベルの上昇を示しました。 GCRの場合と同様に（図1d）、skb1Δはrad51Δの染色体喪失を減少させますが、野生型細胞では減少させません（図3e）。これは、Skb1がrad51Δ細胞でGCRと染色体の喪失を引き起こすことを示しています。 Skb1 は、PRMT5 アルギニン メチルトランスフェラーゼ (RMTase) の分裂酵母ホモログです 44,63。 PRMT5 は、乳がんを含む多くの悪性腫瘍で過剰発現されており、がんの発症に関与しています 64。 興味深いことに、ヒストン、Fen1 DNA フラップ エンドヌクレアーゼ、p53 など、クロマチンの構造と複製に影響を与えるタンパク質が PRMT5 基質として発見されています 65、66、67、68。 Skb1 は、細胞周期の進行を負に制御する p21 活性化キナーゼ (PAK) である Shk1 とも相互作用します 69。 RMTase 活性に必須の残基である 57 skb1-F319Y および skb1-E422A、E431A を変異させると、GCR 率が大幅に低下し、Skb1 が RMTase 活性を通じて GCR を促進することが示唆されました。 将来的には、染色体不安定性を引き起こす Skb1 RMTase の主要な基質を特定することが重要です。 それにもかかわらず、我々の発見はセントロメアにおけるGCRの機構を解明するための新たな道を切り開いた。

この研究で使用した分裂酵母株は補足表 1 にリストされており、要求に応じて対応著者から入手できます。 この研究で使用した DNA プライマーを補足表 2 に示します。特に記載のない限り、細胞は酵母エキス (YE) 培地またはエディンバラ最少培地 2 (EMM)70 で 30 °C で増殖させました。 アミノ酸または塩基を最終濃度 225 mg L-1 で添加しました。 酵母窒素塩基（YNB）培地には、7 g L-1 の酵母窒素塩基（BD Difco、BD 291940）および 20 g L-1 グルコースが含まれていました。 YNB 培地に 1 g L-1 5-フルオロオロチン酸 (Apollo Scientific、PC4054) および 56 mg L-1 ウラシル (Nacalai Tesque、35824-82) を添加して 5-FOA 培地を調製します。 固体培地には 1.5% アガロースが含まれていました (Nacalai Tesque、01028-85)。 酵母の形質転換は、酢酸リチウム/PEG 法 71 によって実行されました。 酵母細胞を YE または YE3S 培地で対数期 (1 ～ 2 × 107 細胞 mL-1) まで増殖させ、遠心分離によって回収しました。 細胞を滅菌水で１回、１ｍＬのＬｉＡｃ／ＴＥ緩衝液（０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で２回洗浄した。 細胞は、> 2 × 109 細胞 mL-1 で LiAc/TE バッファーに懸濁されました。 100μLの細胞懸濁液を5μLのサケ精子DNA（10mg mL-1）および導入DNAと混合し、室温で10分間インキュベートした。 ２６０μＬのＰＥＧ／ＬｉＡｃ／ＴＥ（４０％ ＰＥＧ４０００、０．１Ｍ酢酸リチウム、１０ｍＭ トリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を添加した後、チューブを回転させながらさらに３０分間インキュベートした。 43 μL のジメチルスルホキシド (DMSO) を加えた後、チューブを 42 °C で 5 分間インキュベートしました。 503 × g で 30 秒間遠心分離して細胞を回収し、YE または YE3S 培地に懸濁し、非選択培地にプレーティングしました。 1 日間のインキュベーション後、最終濃度 100 μg mL-1 の G418 (ナカライテスク、09380-86) またはハイグロマイシン B (ナカライテスク、09287-87) または clonNAT (Werner) を補充した培地に細胞をレプリカプレーティングしました。 BioAgents、5.001.000）を 50 μg mL-1 で添加して形質転換体を選択します。 rad52 変異体の例外的に大きなコロニーは、fbh1 変異が含まれている可能性があるため、検出しませんでした62。

rad51Δ 細胞で GCR を引き起こす遺伝子を検索するために、参考文献で以前に記載されているように、基本的に酵母にランダムな突然変異を導入しました。 32. 亜硝酸は、野生型細胞と同様に DNA 修復欠損細胞に効率的に変異を導入するため、変異原として使用されました 72。 EMM で増殖させた ChLC (TNF5411) を含む rad51Δ 細胞を対数期で収集し (5 × 106 細胞 mL-1)、水に懸濁し、4 °C で一晩保存しました。 遠心分離後、硝酸ナトリウム（Wako、195-20562）を 0.5 M 酢酸ナトリウム（pH 4.8）に溶解して使用前に調製した 0.01 M 亜硝酸溶液 0.8 mL に細胞を懸濁し、室温で 20 分間インキュベートしました。 等量の停止緩衝液（３．６％Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏおよび１％酵母抽出物）を細胞懸濁液に添加した後、細胞をＥＭＭ＋ＵＡプレート上にプレーティングした。 EMM プレートを使用して測定された突然変異誘発細胞のプレーティング効率は約 10% でした。 24,000 の独立したクローンを EMM+UA プレート上でパッチとして 30 °C で 2 ～ 3 日間インキュベートし、その後 5-FOA+UA プレートに移して、GCR または点突然変異に起因するウラシル栄養要求性の割合を半定量的に決定しました。 ura4遺伝子。 80 クローンでは、5-FOA+UA プレート上で生成されるコロニーの数が減少しました。 PFGE 分析により、6 個に親 ChLC の異常なサイズが含まれていることが示されました。 残りの 74 クローンは、ChLC を含む野生型細胞と交配されました。 3 つのクローンが再現性よく GCR 率の低下を示しました。 ゲノム DNA のディープシークエンシングは MiSeq (Illumina、サンディエゴ、カリフォルニア州) を使用して実行され、変異はプール連鎖解析によって同定されました 73,74。 親株のヌクレオチド配列データと、3 つのクローンのうちの 1 つを戻し交配して得られた 9 つの変異分離株のプールは、DDBJ Sequenced Read Archive でそれぞれアクセッション番号 DRX042095 および DRX042098 で入手できます。

srr1::kanMX6 株は、2 ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応 PCR75 によって作成されました。 srr1-kan3およびsrr1-kan5プライマーは、3'側がsrr1に相補的であり、5'側がpFA6a-kanMX6プラスミド76上のkanMX6遺伝子に相補的であるように設計された。 PCRの最初のラウンドでは、srr1-kan3/srr1-3またはsrr1-kan5/srr1-1プライマーペアおよび鋳型として分裂酵母ゲノムDNAを使用して、0.5kbのsrr1隣接領域を増幅した。 ２回目のＰＣＲは、２つのＰＣＲ断片、ｐＦＡ６ａ－ｋａｎＭＸ６およびｓｒｒ１－１／ｓｒｒ１－３プライマーの存在下で実施され、ｓｒｒ１：：ｋａｎＭＸ６構築物を含むＤＮＡ断片を生成した。 2.5 kb PCR フラグメントを酵母に導入しました。

skb1::kanMX6 (または skb1::hphMX6) 株は、上記と同様に作成されました。 PCRの最初のラウンドでは、skb1-1/skb1-kan5またはskb1-kan3/skb1-2プライマーペアを使用して、それぞれ0.5 kbのskb1隣接領域を増幅しました。 2 回目の PCR は、2 つの PCR フラグメント、pFA6a-kanMX6 (または pFA6a-hphMX6)、および skb1-1/skb1-2 プライマーの存在下で実行され、skb1::kanMX6 または skb1 を含む DNA フラグメントを生成しました。 ::hphMX6 コンストラクト。 2.5 kb または 2.7 kb PCR フラグメントを酵母に導入しました。

srr1-W157R変異株を作製するために、ura4+遺伝子をura4-D18細胞のsrr1遺伝子に導入し、ura4+:srr1細胞を作製した。 PCR の最初のラウンドでは、srr1-F1/srr1-ura4AN5 および srr1-ura4AN3/srr1-R1 プライマーペアを使用して 0.5 kb の領域を増幅しました。 2 回目の PCR は、2 つの PCR フラグメント、ura4+ ゲノムフラグメントを含むプラスミド、および srr1-F1/srr1-R1 プライマーの存在下で実行されました。 3 kb PCR フラグメントを酵母細胞に形質転換し、ura4+ 形質転換体を EMM 培地上で選択しました。 次に、スクリーニングで単離したsrr1-W157R skb1-A377V変異体から調製した鋳型DNAとsrr1-1/srr1-R1プライマーを用いたPCRにより、srr1-W157R変異を含むゲノム領域を増幅した。 1.5 kb PCR 産物を ura4+:srr1 株に導入し、ura4- 形質転換体を 5-FOA プレート上で選択しました。 DNA 配列決定により、srr1-W157R 変異の組み込みが確認されましたが、追加の変異は存在しませんでした。 ura4+:skb1 株の構築に続いて、skb1-F1/skb1-2 プライマーを使用したことを除き、同じ方法で skb1-A377V 株を作成しました。

srr1-H148A 変異体フラグメントも 2 ラウンドの PCR で作成されました。 まず、srr1-H148A-F/srr1-R1およびsrr1-H148A-R/srr1-F1プライマー対をそれぞれ使用し、鋳型として分裂酵母ゲノムDNAを使用して、0.6および0.5kbの断片を増幅した。 srr1-H148A-F プライマーと srr1-H148A-R プライマーの両方に srr1-H148A 変異が含まれています。 2 つの重複する PCR フラグメントを、srr1-F1/srr1-R1 プライマーの存在下での 2 回目の PCR で結合しました。 1.1 kb の産物を ura4+:srr1 株に導入し、ura4- 形質転換体を 5-FOA プレート上で選択しました。 srr1-D111A、P112A 変異体も同様の方法で作成されました。 PCR の最初のラウンドでは、srr1-DPAA-F/srr1-R1 および srr1-DPAA-R/srr1-F1 プライマー対を使用して、それぞれ 0.7 kb および 0.5 kb の断片を増幅しました。 2 つの PCR フラグメントは、srr1-F1/srr1-R1 プライマーを含む 2 回目の PCR 反応で結合されました。 1.1 kbの産物をura4+:srr1株に導入した。 skb1-F319Y および skb1-E422A,E431A 変異体は、skb1-F1/skb1-F319Y-R および skb1-F319Y-F/skb1-R1 プライマーペア、および skb1-F1/skb1-doubleE-R と skb1-F1/skb1-doubleE-R を使用して同様の方法で生成されました。それぞれ skb1-doubleE-F/skb1-R1 プライマーペア。 点変異は正しく組み込まれていますが、追加の変異はサンガー配列決定によって確認されませんでした。

GCR 率は、参考文献で前述した変動テストによって決定されました。 36. 酵母細胞を EMM+UA プレート上で 6 ～ 8 日間インキュベートしました。 単一コロニーを使用して、10 mL EMM+UA 液体培地に接種しました。 1 ～ 2 日間のインキュベーション後、細胞を 5-FOA+UA および YNB+UA プレートに播種しました。 5 ～ 9 日間のインキュベーション後、5-FOA+UA および YNB+UA 上に形成されたコロニーを計数して、それぞれ Leu+ Ura- および Leu+ 細胞の数を決定しました。 各 5-FOA+UA プレートから約 6 個のコロニーを EMM+UA 上に画線してコロニー サイズを調べ、次に EMM+U プレートに移してアデニン栄養要求性を検査しました。 GCR を示す Leu+ Ura- Ade- 細胞の数は、Leu+ Ura- 細胞の数から Leu+ Ura- Ade+ 細胞の数を引くことによって得られました。 細胞分裂あたりの GCR 速度は、参考文献に記載されているように決定されました。 77. 酵母の培養を開始したとき、さまざまなサイズのコロニーをランダムに拾い上げました。 PFGE 分析用に、出現率に応じて、大小両方のコロニーを 5-FOA+UA プレート上で回収しました。

染色体喪失率は、参考文献で以前に説明されているように、変動テストによって決定されました。 27. 3 ～ 4 日間のインキュベーション後に YE3S プレート上に形成された単一コロニーを滅菌水に懸濁し、細胞を YE プレート上にプレーティングしました。 4 ～ 6 日間のインキュベーション後、白と赤のコロニーを数えました。 ade6 欠損を示す赤色のコロニーを YE3S および EMM+UA プレートに移し、ロイシン栄養要求性を検査しました。 YE3S プレート上で増殖させたコロニーを EMM+UL および EMM+AL プレートにレプリカプレーティングして、それぞれアデニンおよびウラシル栄養要求性を試験しました。 ChLC の染色体喪失を示す Leu-Ura-Ade- 細胞の数とコロニー形成細胞の総数を使用して、細胞分裂あたりの染色体喪失率を求めました 77。

同じ親からの複数のクローンを避けるために、各 GCR クローンは独立した培養物から取得されました。 細胞を YE3S 培地中で 25 °C で 12 ～ 24 時間増殖させました。 1 × 108 個の細胞を収集し、2.5 mL の氷冷 50 mM EDTA に懸濁し、4 °C で保存しました。 細胞を遠心分離し、１ｍＬのＣＳＥ緩衝液（２０ｍＭのクエン酸リン酸、１Ｍのソルビトール、５０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．６））に再懸濁した。 スフェロプラストを調製するために、5 μL ザイモリアーゼ 20 T (生化学工業、東京、日本、25 mg mL-1) および 5 μL 溶解酵素 (Sigma、ミズーリ州セントルイス、25 mg mL-1) を細胞懸濁液に添加し、インキュベートしました。 30℃で20～50分間。 4℃、33×gで10分間の遠心分離によってスフェロプラストを回収し、ペレットを140μLのCSE緩衝液に懸濁した。 50 °C に予熱した等量の 1.6% 低融点アガロースゲル (ナカライテスク、01161-12) を細胞懸濁液に加え、型に分配しました。 アガロースプラグを4℃で20分間インキュベートしました。 プラグを SDS-EDTA 溶液 (1% SDS、0.25 M EDTA) 中で 60 °C で 2 時間インキュベートし、次に 0.5 M を添加した ESP 溶液 (0.5 M EDTA、1% N-ラウロイルサルコシン、1.5 mM 酢酸カルシウム) 中でインキュベートしました。 mg mL-1 プロテイナーゼ K (ナカライテスク、39450–01–6) を 50 °C で一晩。 プラグを、0.5 mg mL-1 プロテイナーゼ K を補充した別の ESP 溶液に移し、50 °C でさらに 8 時間インキュベートしました。 プラグは TE 緩衝液 (10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、1 mM EDTA) 中に 4 °C で保存されました。 染色体 DNA は、CHEF-DRII パルスフィールド電気泳動システム (Bio-Rad、Hercules、California) を使用して分離されました。 PFGE は、0.55% Certified Megabase アガロースゲルを使用し、0.5 × TBE 緩衝液 (89 mM トリスホウ酸塩、2 mM EDTA) 中で 4 ℃、40 ～ 70 秒のパルス時間で 4.2 V cm-1 で 24 時間実行されました。 DNA を 0.2 µg mL-1 の臭化エチジウム (EtBr) (Nacalai Tesque、14631-94) で染色し、Typhoon FLA9000 ゲルイメージング スキャナー (GE Healthcare、イリノイ州シカゴ) または GelDoc Go イメージング システム (Bio-Rad、Hercules) を使用して検出しました。 、カリフォルニア州）。 ゲル画像は、ImageJ2 2.9.0 (NIH、米国) または Adob​​e Photoshop Elements 2020 (Adobe、サンノゼ、カリフォルニア州) を使用して処理しました。

3 ～ 4 日間のインキュベーション後に YE (または YE3S) プレート上に形成された単一コロニーを使用して、2 mL の YE (または YE3S) 液体培地に接種しました。 2 mLの一晩培養物を使用して、10 mLの対数期培養物を調製した。 示された菌株の 5 倍段階希釈液を滅菌水で調製しました。 各希釈液から 6 µL を、示された濃度の MMS、HU、CPT、または TBZ を補充した YE (または YE3S) プレート上にスポットしました。 プレートを 30 °C で 3 ～ 5 日間インキュベートしました。 画像は GT-X800 (エプソン、長野、日本) を使用して撮影され、Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe、サンノゼ、カリフォルニア) を使用して処理されました。

細胞抽出物はアルカリ溶解法を使用して調製されました78。 対数期 YE 培養物から 1 × 108 細胞を収集し、1 ml H2O で洗浄し、300 μl H2O に懸濁しました。 300μlの0.6M NaOHを添加した後、細胞懸濁液をチューブを回転させながら30℃で5分間インキュベートした。 6000 rpmで3分間遠心分離した後（TOMY、MX-201）、アルカリ処理した細胞を140μのSDSサンプルバッファー（60 mM Tris-HCl（pH6.8）、5％グリセロール、4％ドデシルナトリウム）で懸濁した。硫酸塩、4% β-メルカプトエタノール、0.005% ブロモフェノール ブルー) を加え、95 °C で 3 分間インキュベートしました。 15,000 rpmで1分間遠心分離（TOMY、Kitman）した後、上清から細胞抽出物を回収し、8％ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）（アクリルアミドとビスアクリルアミドの比、37.5：1）で分離し、移した。 PolyScreen PVDF 転写膜 (Perkin Elmer、NEF1002001PK) に塗布します。 Chk1-HA、HA タグに対するマウスモノクローナル抗体 (16B12、アブカム、マサチューセッツ州ケンブリッジ) (1:2000) およびペルオキシダーゼ AffiniPure ヤギ抗マウス IgG (重+軽) を検出するには (Jackson ImmunoResearch Laboratories、115–035-) 146) (1:10,000) をそれぞれ一次抗体および二次抗体として使用しました。 ブロットは、Supersignal West Femto 基質 (ThermoScientific、34095) を使用して展開されました。 画像は、ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare) を使用してキャプチャされました。

MMSを対数期EMM培養物に最終濃度0.01%まで添加した。 MMS 添加後 0、2、4、6、および 8 時間後に細胞を回収し、70% エタノールに懸濁し、4 °C で保存しました。 細胞を、2 μg mL-1 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール (DAPI) および 4 μg mL−1 カルコフルオール。 細胞懸濁液を封入剤（90％グリセロール、1 mg mL-1 n-没食子酸プロピル、1 mg mL-1 1,4-フェニレンジアミン二塩酸塩、0.1×リン酸緩衝生理食塩水）とポリ-L-リジンでコーティングしたカバースリップ上で混合しました。 。 100 倍の対物レンズ (NA = 1.40、オリンパス、東京、日本) を備えた蛍光顕微鏡 (BX51、オリンパス、東京、日本) を使用して、核と中隔をそれぞれ DAPI とカルコフルオルで視覚化しました。 画像は電荷結合素子カメラ (DP72、オリンパス、東京、日本) を使用して取得し、cellSens Standard 2.3 (オリンパス) および Adob​​e Photoshop Elements 2020 (Adobe、サンノゼ、カリフォルニア州) を使用して処理しました。

EMM (Rpa2-mCherry) または YE (Rad52-GFP) 培地で指数関数的に増殖する細胞を収集し、ガラス底ディッシュ (松波ガラス、大阪、日本、D11130H) に播種し、DeltaVision Personal 蛍光顕微鏡システム (GE Healthcare) を使用して観察しました。これは、CoolSNAP HQ2 CCD カメラ (Photometrics、アリゾナ州ツーソン) と油浸対物レンズ (UAPO 40x、NA = 1.35、オリンパス、東京、日本) を備えたオリンパスの広視野 IX71 蛍光顕微鏡に基づいています。 。 Rpa2-mCherry および Rad52-GFP 病巣を有する核の割合は、ImageJ2 2.9.0 (NIH、米国) を使用して、それぞれ少なくとも 1 つの Rpa2-mCherry および Rad52-GFP 病巣を含む核を計数することによって得られました。 各実験では > 300 個の核が計数されました。 MacOS 用 GraphPad Prism 9 (GraphPad Software、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して、3 つの独立した実験値とその平均をグラフに示しました。 画像は ImageJ2 2.9.0 または Adob​​e Photoshop Elements 2020 を使用して処理されました。

示された株の指数関数的に増殖する細胞を調製し、滅菌水で 5 倍段階希釈しました。 各希釈液から 6 μL を、DMSO または 200 nM 5'a-IAA (東京化成工業、A3390) を補充した YE プレート上にスポットしました。 プレートを２日間インキュベートした。 画像は GT-X800 (エプソン、長野、日本) を使用して撮影され、Adobe Photoshop Elements 2020 (Adobe、サンノゼ、カリフォルニア) を使用して処理されました。

両側マンホイットニー検定と両側フィッシャー正確確率検定は、MacOS 用 GraphPad Prism 9 を使用して実行されました。 両側スチューデント t 検定とピアソンのカイ 2 乗検定は、Microsoft Excel for Mac 16.72 を使用して実行されました。 各統計を導き出すために使用されたサンプルサイズは、図の凡例または補足情報に記載されています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文、補足情報 (補足図 1 ～ 6 および補足表 1 ～ 2)、および補足データ 1 ～ 3 に含まれています。 親株の DNA 配列データと変異分離株のプールは、DDBJ Sequenced Read Archive でそれぞれアクセッション番号 DRX042095 および DRX042098 で入手できます。URL: https://ddbj.nig.ac.jp/resource /バイオプロジェクト/PRJDB4206。 すべての生データセットは、合理的な要求に応じて対応する著者から入手できます。

この記事では、図 1 の凡例が間違って配置され、図の一部と重なっていました。 これは現在修正されています。

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原稿に対する批判的なコメントをくださった沖田亜紀子氏、Jie Su氏、久保田由紀子氏、技術的支援をいただいた大森弘文氏、萱原桂子氏に感謝いたします。 また、AID2 システムを共有してくれた Adam T. Watson と Antony M. Carr にも感謝します。 この研究は、JSPS KAKENHI 助成金番号 221S0002、JP23570212、JP26114711、18K06060、21H02402、および TN に対する上原記念財団助成金番号 202120462 の支援を受けました。

Piyusha Mongia、豊福直子、Ziyi Pan の著者も同様に貢献しました。

大阪大学大学院理学研究科生物科学専攻〒560-0043 大阪府豊中市待兼山1−1

Piyusha Mongia, Naoko Toyofuku, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita, Keitaro Oki & Takuro Nakagawa

大阪大学大学院理学研究科先端研究センター〒560-0043 大阪府豊中市待兼山1−1

Piyusha Mongia, Ziyi Pan, Ran Xu, Yakumo Kinoshita & Takuro Nakagawa

千葉大学医真菌研究センター、千葉県、260-8673

Hiroki Takahashi

久留米大学医学部感染症内科学講座微生物学教室（〒830-0011 福岡県久留米市）

Yoshitoshi Ogura

九州大学医科学部細菌学教室（〒812-8582 福岡市）

Tetsuya Hayashi

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PM、NT、TN がこの研究を発案しました。 PM、NT、および ZP は、RX、YK、KO、および TN の技術支援を受けて、ほとんどの実験を実行しました。ディープ シーケンシングは、HT、YO、および TH によって実行されました。原稿は TN と PM によって書かれ、すべての著者によって承認されました。

Correspondence to Takuro Nakagawa.

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた Gerben Vader と他の匿名の査読者に感謝します。 主な取り扱い編集者: Manuel Breuer。 査読ファイルが利用可能です。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Mongia, P.、豊福, N.、Pan, Z. 他分裂酵母 Srr1 および Skb1 はセントロメアでの同染色体形成を促進します。 Commun Biol 6, 551 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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受信日: 2022 年 10 月 14 日

受理日: 2023 年 5 月 9 日

公開日: 2023 年 5 月 26 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04925-9

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